[發(fā)明專利]基于已知E1查找特異性介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)E2-E3的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210401583.X
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102936618A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張倩;周亞竟;陳慧卿;陳克平;麥維軍;劉曉勇;何遠(yuǎn)清;李國輝;張磊;劉留;樊曉婷;宋惠芳
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;G01N33/68
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，特指一種從人體細(xì)胞眾多E3中查找出特異性識別靶蛋白泛素連接酶E3和調(diào)控靶蛋白泛素化反應(yīng)的E2/E3系統(tǒng)的方法。

技術(shù)背景

在各種形式的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中，泛素化修飾近年來引起了越來越廣泛的關(guān)注。與磷酸化修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種可逆的共價(jià)修飾過程，它通過調(diào)節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等情況，在細(xì)胞生命活動(dòng)的許多進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

被多聚泛素化修飾(Poly-ubiquitination)的靶蛋白一般會(huì)被蛋白酶體識別進(jìn)而被降解，此過程主要涉及三種關(guān)鍵的酶：活化酶E1，結(jié)合酶E2和連接酶E3。蛋白質(zhì)被泛素化修飾的作用機(jī)制為：首先由E1在ATP能量作用下通過其活性中心的Cys殘基與泛素的C端形成硫酯鍵活化單個(gè)游離的泛素，然后E1將活化的泛素遞交給E2，最后由E3募集特異的底物和E2，并介導(dǎo)泛素從E2轉(zhuǎn)移到靶蛋白。由于蛋白酶體識別泛素化的蛋白并將其降解是一個(gè)非特異性的進(jìn)程，因此，E3在整個(gè)蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它決定了反應(yīng)的特異性。人類蛋白質(zhì)組中含有兩種E1酶、50多種E2酶、600多種E3酶(Bhoj,?V.?G.?&?Chen,?Z.?J.,?Nature,?2009,?458:430-437)。E3酶是泛素修飾途徑中決定底物特異性的關(guān)鍵酶，它可以分為兩大類，即含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3酶(Zheng,?N.,?Structure,?2003,?11:?5-6)和其它含有RING結(jié)構(gòu)域或類似RING結(jié)構(gòu)域的E3酶(Petroski,?M.?D.,?et?al.,?Nat?Rev?Mol?Cell?Biol,?2005,?6:?9-20)。

幾乎所有主要的DNA修復(fù)途徑、損傷避免機(jī)制和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)響應(yīng)等過程都或多或少地受到泛素化和（或）類泛素化修飾SUMO修飾途徑的調(diào)控。泛素化和SUMO參與多種DNA的修復(fù)過程，如跨損傷修復(fù)(Translesion?synthesis)，核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide?excision)，同源重組(Homologous?recombination)等。作為一種最主要的聚合酶，DNA聚合酶δ（Pol?δ）在各種形DNA修復(fù)過程中通過重新合成?DNA（Re-synthesis?of?DNA）和缺口填補(bǔ)（Gap-filling）起著重要的作用(Branzei,?D.?&.?Foiani,?M.,?Nat?Rev?Mol?Cell?Biol,?2008,?9:?297-308)。通過對人Pol?δ?進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Pol?δ?本身也是一個(gè)DNA損傷響應(yīng)的靶目標(biāo)(Zhang,?S.,?et?al.,?J?Biol?Chem,?2007,?282:?15330-40)。在體外培養(yǎng)的人細(xì)胞中，通過遺傳毒物處理或射線誘導(dǎo)而引起DNA損傷的情況下，Pol?δ?的小亞基p12在ATR/Chk1通路調(diào)控下以泛素化依賴的形式降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Pol?δ由原來的四聚體形式Pol?δ4轉(zhuǎn)換為三聚體Pol?δ3以應(yīng)對DNA損傷?(Meng,?X.,?et?al.,?Nucleic?Acids?Res,?2009,?37:?647-657)。類似的研究也表明，p12和Pol?δ的另外一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p68也能被泛素化和SUMO修飾(Liu,?G.?&.?Warbrick,?E.,?Biochem?Biophys?Res?Commun,?2006,?349:?360-6)，但到目前為止，對p12被降解（下調(diào)）的泛素修飾機(jī)制不清楚，其關(guān)鍵點(diǎn)在于，還沒有建立一個(gè)很好的方法從眾多的E3中確定出特異性識別和介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾的連接酶E3，尋找E2/E3系統(tǒng)調(diào)控靶蛋白的泛素化修飾途徑成為一項(xiàng)令人“恐怖”的實(shí)驗(yàn)。

癌癥是一種由遺傳和表觀遺傳改變，以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的一大類疾病，而泛素修飾系統(tǒng)則由一系列能催化細(xì)胞內(nèi)靶蛋白泛素化的酶和底物蛋白所組成，對細(xì)胞內(nèi)的多種功能進(jìn)行調(diào)控，如果泛素修飾系統(tǒng)出現(xiàn)問題將引起人體內(nèi)的多種病理改變，如各種腫瘤的發(fā)生等。鑒于Pol?δ所具有的特殊生物學(xué)功能以及泛素蛋白修飾途徑在DNA修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵性作用，闡明Pol?δ小亞基p12降解的泛素化修飾機(jī)制，對理解多種疾病的發(fā)生機(jī)制和遺傳信息的調(diào)控表達(dá)有著重要意義，而查找出特異性識別靶蛋白p12的E3和介導(dǎo)p12泛素化修飾的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)已成為目前制約我們了解p12降解的泛素化修飾機(jī)制的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容