[發明專利]利用單管巢式實時聚合酶鏈反應(PCR)的改良結核菌診斷方法

有效

• 申請號: 201210400806.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103509790A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 李惠泳
• 申請（專利權）人: 延世大學校原州產學協力團
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 張淑珍;王維玉

1.一種引物組，其特征在于，所述引物組由序號1-4，序號6-9及序號12-15的引物構成。

2.一種結核菌檢測試劑盒，其特征在于，所述結核菌檢測試劑盒包括權利要求1中所述的引物組。

3.根據權利要求2所述的結核菌檢測試劑盒，其特征在于，還包括探針。

4.根據權利要求3所述的結核菌檢測試劑盒，其特征在于，所述探針選自由序號5、序號10-11及序號16構成的群。

5.根據權利要求3所述的結核菌檢測試劑盒，其特征在于，所述探針的5'端和3'端標有熒光劑。

6.根據權利要求5所述的結核菌檢測試劑盒，其特征在于，所述5'端標有的熒光劑是選于由6-羧基熒光素、六氯乙烷-6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素及花青素5構成的群，所述3'端標有的熒光劑是6-羧甲基-若丹明或BHQ(black?hole?quencher)-1，2，3(BHQ-1，2，3)。

7.根據權利要求2所述的結核菌檢測試劑盒，其特征在于，所述結核菌選于由Mycobacterium?tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti構成的群。

8.一種結核菌檢測方法，其特征在于，包括從樣品中抽取DNA，針對所述DNA進行實時定量PCR，將序號1-2、序號6-7及序號12-13的第一引物和序號3-4、序號8-9及序號14-15的第二引物與所述DNA放入同一管內，進行增幅的階段。

9.根據權利要求8所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述管還包括探針。

10.根據權利要求9所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述探針選自由序號5、序號10-11及序號16構成的群。

11.根據權利要求9所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述探針的5'端和3'端標有熒光劑。

12.根據權利要求8所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述結核菌選于由Mycobacterium?tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti構成的群。

13.根據權利要求8所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述第一引物及所述第二引物的濃度為10pg。

14.根據權利要求8所述的結核菌檢測方法，其特征在于，所述樣品為咳痰、小便或腫瘤組織。

15.一種定量方法，其特征在于，所述遺傳基因定量方法包括以下階段：

a.在存在于單管的序號1-4、序號6-9及序號12-15的引物組成物中，混合自試料抽取出的菌的DNA，準備遺傳基因分析試料的階段；

b.在所述a階段的遺傳基因分析試料中，進行實時巢式PCR，獲取PCR產物的階段；

c．對所述b階段的PCR產物進行定量，獲取定量曲線的階段；及

d.利用所述定量曲線，對存在自試料抽取的菌的DNA的rpoB及IS6110遺傳基因特異遺傳基因定量的階段。

16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法還包括選自管內序號5、序號10-11及序號16構成群的探針。

17.一種改善結核菌敏感性及特異性方法，其特征在于，所述改善結核菌敏感性及特異性方法是在利用巢式實時PCR檢測結核菌的方法中，將序號1-2、序號6-7及序號12-13的第一引物和序號3-4、序號8-9及序號14-15的第二引物放入同一管內，進行增幅，對選自Mycobacterium?tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.canetii及M.microti構成群的結核菌的敏感性和特異性進行改善的方法。

18.一種試劑盒的結核菌檢測用途，其特征在于，所述試劑盒的結核菌檢測用途包括由序號1-4、序號6-9及序號12-15的引物構成的引物組。