[發明專利]利用單管巢式實時聚合酶鏈反應(PCR)的改良結核菌診斷方法

有效

• 申請號: 201210400806.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103509790A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 李惠泳
• 申請（專利權）人: 延世大學校原州產學協力團
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 張淑珍;王維玉

技術領域

本發明涉及一種利用單管巢式實時聚合酶鏈反應（PCR）的改良結核菌診斷方法，尤其是一種利用兩組結核菌特殊引物的單管巢式PCR方法，本發明的方法診斷迅速，有利于特異且具有高敏感性的結核菌診斷。?

背景技術

一般來說，結核是呼吸道感染結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)而引發的感染性疾病中的一種，經預測全世界約有三分之一的人口感染了結核菌，依據世界衛生組織2010年統計，一年約有880萬人成為新的結核患者，其中約有110萬人死于結核。韓國國內的結核攜病率雖呈減少趨勢，但是結核患者中女性和兒童患者人數與日俱增，成為一大社會健康問題。為了降低這種結核的發病率及死亡率，結核治療及管理顯得非常重要，需要特異性敏感性的檢測方法。?

在結核的檢查室診斷方法中，主要采用抗酸染色法和抗酸分支桿菌培養檢測法。通常使用的抗酸染色法價格低且可迅速出來結果，被廣泛應用于結核檢測，但是結核菌菌數必須達到5×10^3～4個，才能檢測出來，與培養法相比，敏感性低，無法區別結核菌和非結核性抗酸菌。與此相比，培養法作為結核診斷的標準方法，只需有10^1～2個結核菌即可檢測出結果，但是結核菌的特性上需要很長時間（四至八周），無法實現迅速檢測。另外，利用咳痰作為檢查對象進行檢查時，很難檢查出肺部以外的結核，對于不容易取得咳痰的患者、兒童和女性患者，以及結核和HIV交叉感染的患者來說，會有患者呼吸器官的干酪樣壞死及抗酸菌數量減少等情況，導致不易診斷結核。?

為了更加迅速和精密地檢測結核，開發出聚合酶鏈反應(polymerase?chain?reaction,PCR)、實時聚合酶鏈反應(real-time?PCR)等確認結核菌DNA的核酸擴增檢測(nucleic?acid?amplification?test,NAAT)。其中最典型的一種PCR就是對檢體DNA的特異部位進行2³⁵個以上的增幅，以電泳確認，與染色法和培養法相比，可?在當天出來準確的檢查結果，但是此方法需要熟練的操作，也會發生因DNA增幅產物對核酸診斷檢查環境的污染，導致偽陽性結果。為了進行更便利更安全的檢測，利用熒光染料標記的特異低核苷酸探測劑（oligonucleotide?probe），對增幅產物進行實時確認的實時PCR被廣泛應用于結核診斷。以實時PCR為本的常用化研究或試劑盒中，大部分以單管實時PCR進行診斷。?

但是在檢體中存在較少數量結核菌的咳痰中，為了確認結核菌，使用AFB染色法，若要確認陽性，至少每1毫升的咳痰中須存在10⁵個以上的菌數方可。為了檢測檢體內少量存在的結核菌，需要敏感性更高的診斷方法。另外在結核患者中，腎臟結合患者使用小便作為檢體，易于檢測結核菌，但是其他情況則很難通過小便來檢測出結核菌。對于肺結核的情況，從肺中分解出結核菌，核酸（cell-free?nucleic?acid）再通過血液循環系統進入腎臟，從小便中排出，因此可檢測出從小便中排出的的結核菌DNA。但是從小便中排出的結核菌大部分被攔截在腎臟的絲球體網上，為了檢測出小便中排出的結核菌，需檢測無法被絲球體網攔截的小結核菌，約70kDa或100bp以下的核酸可從小便中檢測到結核菌。?

用于增幅標記的IS6110，copy數為1～20copy，在諸多研究中，其中以IS6110為標記的PCR的敏感性最高。但是MTB?complex染色序列與多個NTM類似，最近在MTB?strain中，報道出不具有此遺傳基因的菌株。因此在本發明中，除DNA標記外，以RNA為標記，對用于RNA?polymerase的rpoB遺傳基因，和MTB上所存在R)-1遺傳基因進行編譯的ESAT-6(6kDa?early?secreted?antigenic?target?protein)遺傳基因同時增幅，從而解決偽陽性和偽陰性的問題，從而制造出高敏感性和特異性的實時PCR。?

PCR的應用法中，聚合酶鏈反應法是可以提高PCR增幅的特異性及敏感性的方法，多用于純度較低的DNA或RNA的增幅上。此方法是對兩種引物進行連續PCR的方法，利用目標遺傳基因，進行1^st?PCR，使用在第一PCR產物內邊的第二引物，進行2^nd?PCR。?

在本發明中，進行實時PCR時，使用兩個遺傳基因，將各遺傳基因特異的兩組引物放入同一管中進行增幅，利用單管巢式PCR，與現有的實時PCR相比，可提高特異性和敏感性，可在多種檢體中進行結核診斷。?