[發明專利]茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進

無效

• 申請號: 201210399115.3
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102928362A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 趙毅;鄭先強;謝仁軍;肖璐恒;李延濤;黃炯;唐磊
• 申請（專利權）人: 新疆天康畜牧生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N1/28
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

本發明涉及氨基殘余物的定量檢測，尤其適應新固相多肽合成中，經茚三酮試劑處置，測得吸光值，制得標準曲線，用于判定未知樹脂肽中的殘余氨基含量的方法。

背景技術

在固相法合成多肽的過程中，游離的氨基數量是合成完成度的一種直接體現，但是現在沒有一個準確的方法可以得到殘余氨基的具體數量，以驗證其結果的可信度與準確性；因此制作標準樣品與標準曲線用于對未知樹脂肽中游離的氨基進行定量分析，有著重要的實踐價值。

常規茚三酮檢測法用于固相多肽合成中的-NH2殘基定量的檢測，一般均采用將反應后樹脂的吸光值代入公式，通過計算來確定合成率，此結果易受反應時間、加熱溫度、加熱時間等因素影響，而且由于存在試劑配制的批次差異，從而使結果會有較大的浮動，而且由于合成的不斷進行，氨基酸的增加，也會使得樹脂肽重量發生變化，使得結果判定上的準確度大打折扣，為了避免上述情況的出現，該項目對茚三酮反應試劑進行了改進，可以在短時間內得出一個穩定的結果，并使用脫去保護基后的合成用樹脂作為標準品，建立一條標準曲線，使所有的反應均在同一條件下進行，從而保證了結果的可信度，可以更可靠的對游離氨基進行定量。

文獻檢索披露：常規茚三酮檢測法多是通過顏色的變化來對縮合完成度進行判定；該方法使用2種試劑，試劑A：取0.66mg/ml氰化鉀水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酚乙醇溶液10ml，混勻；試劑B：稱取500mg茚三酮溶于10ml無水乙醇中；進行合成完成度檢測時，取縮合反應完成后的樹脂肽3mg，使用無水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入試劑A?0.15ml，試劑B?0.05ml，100℃加熱10分鐘，看顏色變化來判定縮合完成度，顏色如果為藍色或綠色就判定為縮合不完全，顯黃色判定為縮合完全。

本發明構思是改進的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，用合成的樹脂作為標準品，制作標準曲線，對合成率進行一個判斷，其解決的主要問題，一是合成樹脂標準的建立；二是對游離氨基定量檢測范圍的確定；三是吸光值的穩定性的確定；四是反應液改進后不加氰化鉀，減少反應液配制的危險性，該定量方法有重要的應用推廣價值。

發明內容

本發明的目的在于：改進的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，依據標準品樹脂的吸光值制作標準曲線，可以得到未知樹脂肽樣品中的殘余氨基含量，實現了準確定量。

本發明的目的是這樣實現的：茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進，用與合成反應相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，制作標準曲線，對未知的樣品進行殘余氨基定量檢測，其步驟如下：

其1樣品處理：

稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計算樹脂摩爾數A；用帶Fmoc保護基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾；將1A摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應2小時，得到樹脂肽；再經25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護基后的樹脂肽，備用；

其中25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得；

其中樹脂摩爾數的計算公式：

A-mSD]]>

式中：A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數；

m為Rink_Amide_MBHA樹脂的克數；

SD為Rink_Amide_MBHA樹脂取代量值；

其2檢測步驟：

1）將取去除保護基后的樹脂肽15mg，使用無水甲醇溶液20ml對其清洗3次，經真空干燥機處置，其溫度45℃，真空度93.3～98.6KPa；干燥結束，稱取1.0mg，1.5mg，2.0mg，2.5mg，3.0mg；分別加入300ul?Buffer?A：和75ul?Buffer?B，混和均勻，用100℃水浴加熱15min，并置于15-20℃水中冷卻至室溫；取25ul的反應后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在OD570下進行吸光值讀取，并制作標準曲線；