[發(fā)明專利]茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210399115.3
• 申請(qǐng)日: 2012-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN102928362A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙毅;鄭先強(qiáng);謝仁軍;肖璐恒;李延濤;黃炯;唐磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31;G01N21/78;G01N1/28
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

1.茚三酮檢測(cè)法對(duì)固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進(jìn)，其特征在于：用與合成反應(yīng)相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知的樣品進(jìn)行殘余氨基定量檢測(cè)，其步驟如下：

其1樣品處理：

稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計(jì)算樹脂摩爾數(shù)A；用帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾；將1A摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應(yīng)2小時(shí)，得到樹脂肽；再經(jīng)25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護(hù)基后的樹脂肽，備用；

其中25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得；

其中樹脂摩爾數(shù)的計(jì)算公式：

式中：A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數(shù)；

m為Rink_Amide_MBHA樹脂的克數(shù)；

SD為Rink_Amide_MBHA樹脂取代量值；

其2檢測(cè)步驟：

1）將取去除保護(hù)基后的樹脂肽15mg，使用無(wú)水甲醇溶液20ml對(duì)其清洗3次，經(jīng)真空干燥機(jī)處置，其溫度45℃，真空度93.3～98.6KPa；干燥結(jié)束，稱取1.0mg，1.5mg，2.0mg，2.5mg，3.0mg；分別加入300ul?Buffer?A：和75ul?BufferB，混和均勻，用100℃水浴加熱15min，并置于15-20℃水中冷卻至室溫；取25ul的反應(yīng)后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在OD570下進(jìn)行吸光值讀取，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2）稱取待測(cè)樣2.0-3.0mg，加入Buffer?A：300ul；Buffer?B：75ul，混勻，100℃水浴加熱15min，并用冷水冷卻，取25ul的反應(yīng)后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在OD570下測(cè)定吸光值；

其中Buffer?A的配制：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混勻；

其中Buffer?B的配制：500mg茚三酮+10ml乙醇；

3）由于使用未合成的Rink?Amide_MBHA樹脂作為標(biāo)準(zhǔn)品，所以在計(jì)算時(shí)需要將由于縮合所增加的分子量減去，以保證計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性；

去除樹脂肽增量的影響公式：

式中X：去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；

W：樹脂肽理論分子量；

m：樹脂肽實(shí)際稱量重量；

SD：Rink_Amide_MBHA樹脂取代量值；

其中4mer樹脂肽的理論分子量為：541.73；

Rink_Amide_MBHA樹脂取代量值為：0.38mmol/g。

2.按照權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于：選用的合成用樹脂為Rink?Amide_MBHA?Resin，購(gòu)自天津南開和成科技有限公司，貨號(hào)：HCRAm04-1-1；哌啶購(gòu)自Sigma，貨號(hào)：110-89-4；氮甲基吡咯烷酮購(gòu)自張家港合泰化工有限公司，貨號(hào)：872504；茚三酮購(gòu)自Sigma，貨號(hào)：N4876;吡啶購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，貨號(hào)：xk13-201-00115；帶Fmoc保護(hù)基的氨基酸，購(gòu)自吉爾生化的上海有限公司。