[發明專利]一種用于檢測乙型腦炎疫苗病毒抗原含量的方法

有效

• 申請號: 201210398684.6
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103777022A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 高旭哲;戰辛;劉暢;張玥
• 申請（專利權）人: 遼寧成大生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 韓輝

技術領域

本發明涉及一種生物制劑的檢測方法，特別是涉及一種利用雙抗夾心ELISA原理快速檢測乙腦病毒抗原含量、鑒別乙腦疫苗真偽的用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，屬于生物技術領域。特別適合應用在乙型腦炎疫苗生產企業的質量控制環節。?

背景技術

流行性乙型腦炎是由乙腦病毒引起、由蚊蟲傳播的一種急性傳染病。乙腦的病死率和致殘率高，是威脅人群特別是兒童健康的主要傳染病之一。我國是乙腦高流行區，在20世紀60年代和70年代初期全國曾發生大流行，70年代以后隨著大范圍接種乙腦疫苗，乙腦發病率明顯下降，近年來維持在較低的發病水平。由此可見乙腦疫苗在預防乙腦流行上起著重要作用。而乙腦病毒抗原作為乙腦疫苗的最主要成分，其含量對疫苗質量起到至關重要的作用。?

在現有技術中，國內并沒有公開乙腦病毒抗原含量檢測的方法，也查不到國外企業的相關報道。根據生產企業實際的生產情況，迫切需要能有一種檢測乙腦病毒抗原含量的方法，以便有效的預知成品疫苗的抗原含量，為疫苗成品生產提供可靠的定量數值依據，并用于快速鑒別疫苗真偽。?

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術的上述不足，公開一種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法。本發明應用ELISA雙抗體夾心原理，首先在96孔酶標板上包被乙腦病毒多克隆抗體，包被完成后每孔分別加入乙腦陽性、陰性對照及經過梯度稀釋后的待檢樣品，37℃孵育后清洗酶標板，加入乙腦病毒E蛋白單克隆抗體，37℃孵育后清洗酶標板，加入辣根酶標記結合物，37℃孵育后清洗?酶標板，加底物顯色液顯色，終止后酶標儀讀取OD值。計算P/N值，確定抗原含量。本發明可快速檢測乙腦抗原含量，以及鑒別乙腦疫苗的真偽。并為乙腦疫苗的生產提供有利的數據支持。?

本發明給出的技術方案是：這種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步驟：?

(1)兔抗乙型腦炎多克隆抗體制備?

1)注射抗原制備(乳化)震蕩CFA(完全弗氏佐劑)或IFA(不完全弗氏佐劑)，4℃下與同體積的乙腦病毒純化原液在玻璃試管內混合，直至乳狀劑形成，擠出一滴至冷水表面上，如在水面上舉成一滴，證明可以使用，如液滴分散，繼續混勻，將配置成的乳狀劑轉移至2.5ml注射器，準備注射；?

2)免疫程序?

注射前兔子耳源取血作為實驗血清空白對照：?

初次免疫?

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量1ml/點，共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量約0.8mg；?

加強免疫(間隔一周)?

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.5ml/點，注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量約0.4mg。?

加強免疫(間隔一周)?

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.2ml/點，注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量約0.2mg，?

間隔一周后，心臟采血制備抗血清；?

3)分離血清檢測抗體?

將新鮮采集的血液，分裝至15ml無菌離心管中，室溫條件下斜面放置4小時，使血塊形成，4℃下放置過夜使血塊縮小；使用無菌槍頭剝離血塊，將血清轉移至另一新離心管中，3000g離心10min，保留上清液，然后對血清中抗體進行檢測；?

4)抗血清IgG純化?

鹽析法粗體—硫酸銨沉淀?

4-1在離心管中加入5ml血清和5ml?0.02mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液，混勻，用槍頭吸取10ml?SAS，邊滴加邊攪拌，使溶液飽和度達到50％，用滴管邊加邊攪拌，攪拌時不要過急以免產生過多泡沫，致使蛋白質變性，加完后在室溫放置4℃過夜，以3000r/min離心10min，白蛋白在上清液中，沉淀為球蛋白，棄去上清液，留下沉淀部分；?

4-2將所得沉淀再溶于5ml?0.02mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的飽和度達35％，加完后4℃放置20min，以3000r/min離心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀為IgG，棄去上清液，即獲得粗制的IgG沉淀；?

4-3將獲得的粗IgG沉淀溶解于5ml?0.02mol/L，pH?7.0磷酸緩沖液中；?

5)蛋白A親和純化?

5-1柱平衡：用Binding?buffer清洗柱，5-10個體積；?

5-2上樣：使用注射器緩慢擠壓1ml樣品進入柱內；?