[發明專利]一種用于檢測乙型腦炎疫苗病毒抗原含量的方法

有效

• 申請號: 201210398684.6
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103777022A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 高旭哲;戰辛;劉暢;張玥
• 申請（專利權）人: 遼寧成大生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 韓輝

1.一種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步驟：

(1)兔抗乙型腦炎多克隆抗體制備

1)注射抗原制備

震蕩CFA(完全弗氏佐劑)或IFA(不完全弗氏佐劑)，4℃下與同體積的乙腦病毒純化原液在玻璃試管內混合，直至乳狀劑形成，擠出一滴至冷水表面上，如在水面上舉成一滴，證明可以使用，如液滴分散，繼續混勻，將配置成的乳狀劑轉移至2.5ml注射器，準備注射；

2)免疫程序

注射前兔子耳源取血作為實驗血清空白對照：

初次免疫

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量1ml/點，共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量0.8mg；

加強免疫(間隔一周)

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.5ml/點，注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量0.4mg；

加強免疫(間隔一周)

注射部位為兩肩后側及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.2ml/點，注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量0.2mg，

間隔一周后，心臟采血制備抗血清；

3)分離血清檢測抗體

將新鮮采集的血液，分裝至15ml無菌離心管中，室溫條件下斜面放置4小時，使血塊形成，4℃下放置過夜使血塊縮小；使用無菌槍頭剝離血塊，將血清轉移至另一新離心管中，3000g離心10min，保留上清液，然后對血清中抗體進行檢測；

4)抗血清IgG純化

鹽析法粗體-硫酸銨沉淀

4-1在離心管中加入5ml血清和5ml?0.02mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液，混勻，用槍頭吸取10ml?SAS，邊滴加邊攪拌，使溶液飽和度達到50％，用滴管邊加邊攪拌，攪拌時不要過急以免產生過多泡沫，致使蛋白質變性，加完后在室溫放置4℃過夜，以3000r/min離心10min，白蛋白在上清液中，沉淀為球蛋白，棄去上清液，留下沉淀部分；

4-2將所得沉淀再溶于5ml?0.02mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的飽和度達35％，加完后4℃放置20min，以3000r/min離心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀為IgG，棄去上清液，即獲得粗制的IgG沉淀；

4-3將獲得的粗IgG沉淀溶解于5ml?0.02mol/L，pH?7.0磷酸緩沖液中；

5)蛋白A親和純化

5-1柱平衡：用Binding?buffer清洗柱，5-10個體積；

5-2上樣：使用注射器緩慢擠壓1ml樣品進入柱內；

5-3清洗：使用Binding?buffer清洗柱，5-10個柱體積；

5-4洗脫：使用Elution?buffer洗脫柱，同時收集3個柱體積洗脫組分；

5-5合并洗脫組分，測定IgG的含量為5mg/ml和抗體活性；

(2)ELISA方法的建立

將兔抗乙腦病毒多克隆抗體不同稀釋濃度(5μg/ml，10μg/ml)包被96孔板，200μl/孔，用封口膜封好，置于濕盒中37℃3小時，然后4℃過夜，取出倒空板，加300μl/孔封閉液，用封口膜封嚴后置于濕盒中37℃1小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；

樣品以2倍法稀釋256/512/1024三個稀釋度，將預先包被好的酶標板從-70℃冰箱中取出，用洗板機清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加樣200μl/孔，空白孔由稀釋液代替，用封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育90min；

取出板，洗板機清洗5次，洗液300μl/孔，加乙腦病毒E蛋白單克隆抗體(稀釋度分別10^-410^-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育90min；

取出板，洗板機清洗5次，洗液300μl/孔，加辣根酶標記山羊抗小鼠過氧化物(稀釋度分別10^-410^-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育60min；

取出板，洗板機清洗6次，洗液300μl/孔，加OPD顯色液，200μl/孔，室溫下避光反應30min；

顯色后H₂SO₄終止液，50μl/孔，使用酶標儀，并在492nm測定各孔OD值；

(3)具體實驗樣品檢測

將兔抗乙腦病毒多克隆抗體(濃度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于濕盒中37℃3小時，然后4℃過夜后取出倒空板，加300μl/孔封閉液，再用封口膜封好置于濕盒中37℃1小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；

樣品以2倍法稀釋(64、128、256、512)，將預先包被好的酶標板從-70℃冰箱中取出，洗板機清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加樣200μl/孔，由低稀釋度往高稀釋度加，每次實驗設空白對照、陽性對照、陰性對照各兩孔，加樣后酶標板用封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育90min；

取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300μl/孔，將稀釋度為10^-4的乙腦病毒E蛋白單克隆抗體加到酶標板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育90min；

取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300μl/孔，將稀釋度10^-5的辣根酶標記山羊抗小鼠過氧化物加到酶標板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃濕盒中孵育60min；

取出酶標板，洗板機清洗6次，洗液300μl/孔。加入OPD顯色液，200μl/孔，室溫下避光反應30min；

顯色后加50μl/孔終止液，設定相應的空白，酶標儀492nm測定；

結果判定：

當陰性對照OD值≤0.1，陽性對照OD值≥1.0時，該試驗成立；

若陰性對照平均OD值≤0.05，按0.05計算；

若陰性對照平均OD值＞0.05，按實際OD值計算；

當P/N≥2.1時，則判定樣品在該稀釋度下呈陽性，并確定呈陽性的最大稀釋度；

其中：P是樣品平均OD值N是陰性對照平均OD值。