[發明專利]雙束激光質譜法原位檢測動物組織中藥物分子的方法

無效

• 申請號: 201210398007.4
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN102879456A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 胡勇軍;王紅磊;楊晴;官凱文;李衛星
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于一種小分子藥物開發的檢測技術領域，特別涉及一種應用雙束激光質譜法（L2MS）檢測動物組織中藥物分子的方法。

背景技術

雙束激光質譜法（Two-step?Laser?Desorption/Laser?Ionization?MassSpectrometry,L2MS）是采用兩束激光分別完成氣化/解析和電離的任務，L2MS有如下優點：其一，因解析激光和電離激光在時間和空間上是分開的，因此可以根據實際的需要很方便的單獨優化兩束激光的能量和波長；其次，該實驗技術所需要的樣品量極少，也不需要在待測樣品中人為地添加其它的化學物質作為基質，樣品準備簡單，避免了樣品的二次污染。雙束激光質譜技術以其獨特的優點在分析化學與生命科學領域日益受到重視。

雙束激光質譜法在最近的一二十年間獲得了很大的發展。其應用首先是在生物領域，包括短肽，氨基酸等生物小分子，藥物分子，化學添加劑等化學分子的檢測，Luke?Hanley，Richard?N.Zare等研究團隊都有專門的小組進行此方面的研究，近年來都有文章發表，在此基礎上發展起來的表面分析技術可發展成為一種新的生物芯片分析技術。另外，該技術與顯微成像技術相結合，有望研發出一種新的質譜成像技術，并應用于生命科學領域。最近Hanley教授發表了一篇關于生物質譜成像方面的綜述性文章，介紹了雙束激光質譜方法在該方面的一些最新進展，說明在生物質譜檢測方面，該技術方法將具有很好的發展前景。

亞甲基藍（Methylene?Blue，MB）為一種噻嗪染料類化合物，為水溶性色素。高濃度[(5～10)mg/kg]時直接使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，低濃度[(1～2)mg/kg]時,在還原型輔酶Ⅰ脫氫酶的作用下，能將高鐵還原型蛋白還原為血紅蛋白。早在20世紀30年代就發現亞甲藍可與病毒的核酸及脂質包膜結合，在可見光的作用下，使病毒包膜破損，核酸斷裂，進而導致大多數的脂質包膜病毒和部分非脂質包膜病毒失活。隨后，亞甲基藍的光動力治療一直被人們所利用。但是，目前對亞甲基藍的檢測主要還是比較的少，主要是拉曼光譜以及色譜的方法，但都無法在生物組織內部對亞甲基藍進行檢測。因此，發展一種利用雙束激光質譜法簡單快速檢測生物組織內藥物小分子的方法顯得尤為重要。

發明內容

為了解決上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種雙束激光質譜法原位檢測動物組織中藥物分子的方法，該方法快速原位、無需前期處理，方便、靈敏度極高。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種應用雙束激光質譜法原位檢測動物組織中藥物分子的方法，包括以下操作步驟：

（1）將藥物分子溶液加到離體腫瘤組織上，使藥物分子溶液在離體腫瘤組織中充分擴散；

（2）將經過步驟（1）處理的離體腫瘤組織進行冷凍，用包埋劑將離體腫瘤組織包埋后，用冷凍切片機進行切片，得到離體腫瘤組織切片；

（3）對承載基底石墨棒進行清洗處理，將步驟（2）處理所得離體腫瘤組織切片放在已處理的石墨棒上，把石墨棒固定在雙束激光質譜儀的進樣桿上，經進樣系統進入雙束激光質譜儀的真空設備中進行檢測；

（4）開啟雙束激光質譜儀，雙束激光質譜儀中的兩臺固體激光器分別依次發射脈沖激光，發射的第一束脈沖激光為解析激光，解析激光聚焦后進入電離室中并且照射在石墨棒上的離體腫瘤組織切片上，經過18～30μs延遲，再發射第二束脈沖激光，第二束脈沖激光經過氣體池三倍頻后轉化為真空紫外激光，在氣體池出光口用平凸鏡聚焦分離第二束脈沖激光和真空紫外激光；真空紫外激光聚焦后以平行于石墨棒的方向進入電離室中并且與第一束脈沖激光實現交叉，再對第一束脈沖激光氣化-解析后產生的氣羽進行電離，電離的離子經過飛行管飛行，被微通道板檢測，再通過數據采集裝置顯示及采集，最后在電腦上進行數據處理。

所述步驟（1）是在無菌條件下進行操作的；步驟（1）所述離體腫瘤組織為被Hela細胞感染的老鼠的皮下離體腫瘤組織；所述離體腫瘤組織的大小為15mm×5mm×4mm；所述藥物分子溶液的濃度為1×10^-4mol/L，其用量為10～100μl；所述充分擴散的時間是10～20min。

步驟（1）所述藥物分子溶液是亞甲基藍溶液。

步驟（2）所述進行冷凍是先將經過步驟（1）處理的離體腫瘤組織投入用干冰冷卻的異戊烷中15～20s，再放入-80℃的冰箱里冷凍保存；所述包埋劑是OCT冰凍切片包埋劑；所述冷凍切片機是在-19～-24℃的環境下工作，冷凍切片機工作前提前開機1.5～2.0小時；所述切片的厚度為200～400μm。