[發明專利]適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴增方法

有效

• 申請號: 201210396685.7
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN102864144A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 羅朝鵬;楊軍;王燃;李鋒;魏春陽;金立鋒;金大偉;周小龍;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/40;C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明涉及一種用于煙草病毒基因組擴增和煙草病毒病檢測的通用引物及擴增方法，尤其是適用于煙草黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組擴增和煙草黃瓜花葉病毒病檢測的通用引物及擴增方法，屬于煙草病害研究領域。?

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背景技術

黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus，CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等經濟作物在內的1000多種單子葉和雙子葉植物，造成嚴重的經濟損失，是世界范圍內最重要的植物病毒之一[1]。煙草是茄科植物，作為一種重要的經濟作物，在世界各地種植廣泛。黃瓜花葉病毒是危害煙草的主要病毒病害[2]。?

黃瓜花葉病毒是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，具有典型的三分體正義單鏈RNA?(Positive?sense?single．Stranded?RNA，+ssRNA)基因組，三條基因組分別為RNAl、RNA2和RNA3。根據血清學和核酸序列同源性，CMV株系被劃分為3個亞組：IA、IB和Ⅱ[3,4]。作為一種典型的RNA病毒，CMV基因組序列極易發生變異[5]，對于亞組I和亞組II，組內各株系間的核酸序列同源性在88%以上，而亞組間株系核酸序列同源性只有69%-77%[1]。如此低的序列同源性，給CMV全基因組PCR擴增帶來很大困難。目前，測定CMV基因組全序列，首先要確定CMV株系，主要根據CMV基因組部分區域如CP基因和3′UTR區域的基因序列確定；再根據確定的株系設計特異性全基因組擴增引物進行擴增。這樣設計的特異性引物，用于同組其它株系或其它亞組株系基因組全序列擴增時，由于不同亞組株系間序列同源性低，引物通用性差，匹配性不高，將直接造成擴增失敗。目前還沒有可以適用于CMV所有亞組不同株系基因組全序列擴增的通用引物及一步法RT-PCR擴增方法的報道。?

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發明內容

本發明的目的正是針對上述現有技術所存在的問題而專門提供的一種適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴增方法，即提供一套能夠用于煙草CMV檢測，特別是用于煙草CMV所有亞組株系全基因組擴增的通用引物，本發明的目的還在于提供利用該套引物擴增侵染煙草黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組擴增和檢測CMV的一步法RT-PCR方法。?

本發明的上述技術目的通過以下技術方案實現。?

本發明的通用引物的名稱和核苷酸序列如下：?

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P12：CATGTGATGGGGGAACGTGT；

P21：GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC；

P22：TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC；

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P31：CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG；

P41：CGATTCCAGAGATGCCTTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT；

P51：GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG；

P52：ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA；

P61：CGCTCGCCTGTTGAAGTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。

引物配對方式如下：?

P11和P12配對；P21和P22配對；P11和P31配對；P41和P42配對；P51和P52配對；P61和P42配對。

利用上述的通用引物擴增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，包括以下具體步驟：?

(1)提取樣品RNA，以其為模板，以本發明提供的引物，使用一步法RT-PCR進行擴增；

(2)PCR產物瓊脂糖膠電泳檢測，根據產物條帶有無和大小判斷樣品是否有CMV感染，目的條帶回收，連接T載體，轉化細菌感受態細胞；

(3)進行藍白斑篩選和PCR鑒定，確定陽性菌株，陽性菌株放大培養后，提取質粒；

(4)陽性質粒測序，結果分析，確定是否為CMV，測序結果經過拼接，得到CMV基因組全序列。