[發(fā)明專利]適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴(kuò)增方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210396685.7
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN102864144A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅朝鵬;楊軍;王燃;李鋒;魏春陽;金立鋒;金大偉;周小龍;林福呈
• 申請（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/40;C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物，其特征在于：該通用引物的名稱和核苷酸序列如下：

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P12：CATGTGATGGGGGAACGTGT；

P21：GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC；

P22：TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC；

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P31：CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG；

P41：CGATTCCAGAGATGCCTTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT；

P51：GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG；

P52：ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA；

P61：CGCTCGCCTGTTGAAGTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物，其特征在于：引物配對方式如下：

P11和P12配對；P21和P22配對；P11和P31配對；P41和P42配對；P51和P52配對；P61和P42配對。

3.一種利用權(quán)利要求1所述的通用引物擴(kuò)增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)提取樣品RNA，以其為模板，以本發(fā)明提供的引物，使用一步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增；

(2)PCR產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳檢測，根據(jù)產(chǎn)物條帶有無和大小判斷樣品是否有CMV感染，目的條帶回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞；

(3)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，確定陽性菌株，陽性菌株放大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒；

(4)陽性質(zhì)粒測序，結(jié)果分析，確定是否為CMV，測序結(jié)果經(jīng)過拼接，得到CMV基因組全序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用通用引物擴(kuò)增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，其特征在于：步驟（1）中的RT-PCR?25μl體系為：

反應(yīng)組分組分體積反應(yīng)酶1μl反應(yīng)緩沖液12.5μl上游引物(20 μM)0.5μl下游引物(20 μM)0.5μlRNA0.3-1μl去RNA酶H2O10μl總體積??????? 25μl

RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃?30min，94℃?3min，94℃?30sec，53-58℃?30sec，72℃?2min，28-35個循環(huán)，72℃?10min，4℃保存。