[發(fā)明專利]狂犬疫苗糖蛋白含量的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210396467.3
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103777021A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高旭哲;戰(zhàn)辛;劉暢
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧成大生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標(biāo)代理有限公司 21107
• 代理人: 韓輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物制劑的檢測方法，特別是涉及一種用于狂犬疫苗產(chǎn)業(yè)中的質(zhì)量控制，并能夠快速鑒別狂犬疫苗真?zhèn)蔚目袢呙缣堑鞍缀康臋z測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

狂犬病毒具有較強(qiáng)的神經(jīng)組織嗜性，狂犬病是致死性傳染病。狂犬疫苗在預(yù)防狂犬病起著重要作用。狂犬病毒糖蛋白是狂犬病毒表面抗原的最主要成分，并且是狂犬病毒的主要免疫抗原。其含量和活性對疫苗質(zhì)量起到至關(guān)重要的作用。檢測狂犬病毒的糖蛋白含量間接起到評價(jià)疫苗效力的作用，是對疫苗效力實(shí)驗(yàn)有利補(bǔ)充。相對效力實(shí)驗(yàn)而言，更節(jié)省時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量、對生產(chǎn)流程可控性強(qiáng)等。在現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)并沒有公開狂犬病毒抗原含量檢測的方法，也查不到國外企業(yè)的相關(guān)報(bào)道。根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)實(shí)際的生產(chǎn)情況，迫切需要能有一種檢測狂犬病毒糖蛋白含量的方法，以便有效的預(yù)知成品疫苗的抗原含量，為疫苗成品生產(chǎn)提供可靠的定量數(shù)值依據(jù)，并用于狂犬疫苗真?zhèn)慰焖勹b別。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，公開一種狂犬疫苗糖蛋白含量的檢測方法。本發(fā)明采用ELISA夾心法檢測狂犬病毒抗原含量，首先在96孔酶標(biāo)板上包被狂犬病毒多克隆抗體，加入待檢測樣品，37℃孵育1.5小時(shí)；清洗酶標(biāo)板5次；后加入鼠抗狂犬病毒單克隆抗體，37℃孵育1.5小時(shí)；清洗酶標(biāo)板5次，加抗小鼠的酶結(jié)合物，37℃孵育1小時(shí)；清洗酶標(biāo)板6次.加底物顯色后。酶標(biāo)儀檢測，讀取OD值。計(jì)算樣品的狂犬病毒糖蛋白含量。本發(fā)明可用于狂犬疫苗產(chǎn)業(yè)中的質(zhì)量控制，并能夠快速鑒別狂犬疫苗真?zhèn)巍?/p>

本發(fā)明給出的技術(shù)方案是：這種狂犬疫苗糖蛋白含量的檢測方法，其特征在于有以下步驟：

(1)將人抗狂犬病毒免疫球蛋白適宜稀釋度配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于濕盒中37℃至少3小時(shí)，然后4℃過夜，取出倒空板，加300μl/孔封閉液，再用封口膜封好置于濕盒中37℃至少1小時(shí)，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；

(2)每個(gè)樣品以2倍法稀釋多個(gè)稀釋度(當(dāng)糖蛋白含量較高時(shí)可增大稀釋度)，參考疫苗：以2倍法稀釋8個(gè)稀釋度，將預(yù)先包被好的酶標(biāo)板從-70℃冰箱中取出，用洗板機(jī)清洗至少4次，洗液300μl/孔，倒空板，加樣200μl/孔，第1列加稀釋液作為空白，不加樣品；第2列加參考疫苗，由低稀釋度往高稀釋度加，第4～12列為樣品，加入不同樣品時(shí)應(yīng)更換槍頭，將加完樣的酶標(biāo)板用封口膜封好，置于37℃濕盒中孵育至少90min；

(3)將板取出，用洗板機(jī)清洗至少5次，洗液300μl/孔，將適宜稀釋度的小鼠抗狂犬病毒單克隆抗體25ml，用多道加樣槍加到酶標(biāo)板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃濕盒中孵育至少90min；

(4)將板取出，用洗板機(jī)清洗至少5次，洗液300μl/孔，將適宜稀釋度的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠過氧化物25ml，用多道加樣槍加到酶標(biāo)板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃濕盒中孵育至少60min。

(5)將板取出，用洗板機(jī)清洗至少6次，洗液300μl/孔。加現(xiàn)配制好的顯色液，200μl/孔，室溫下避光反應(yīng)至少30min，同時(shí)打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，加50μl/孔4.5mol/L?H₂SO₄終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀，設(shè)定相應(yīng)的空白，并在492nm測定。

(6)結(jié)果計(jì)算：將所有測定的OD值，逐一輸入計(jì)算模板中，按照參考疫苗糖蛋白含量和所對應(yīng)的OD值做一次回歸方程Y＝aX+b，將同一樣品不同稀釋倍數(shù)下所對應(yīng)的OD值代入方程，計(jì)算各稀釋度的糖蛋白含量，并乘以相對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得到多個(gè)結(jié)果后，選擇結(jié)果相近數(shù)值的平均數(shù)作為檢驗(yàn)的最終結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

在現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)并沒有公開狂犬病毒抗原含量檢測的方法，也查不到國外企業(yè)的相關(guān)報(bào)道。建立此方法可以根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)實(shí)際的生產(chǎn)情況，有效的預(yù)知成品疫苗的抗原含量，為疫苗成品生產(chǎn)提供可靠的定量數(shù)值依據(jù)，并用于快速鑒別疫苗真?zhèn)巍?/p>

附圖說明

圖1為參考疫苗標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1

這種狂犬疫苗糖蛋白含量的檢測方法，有以下步驟：

1.將人抗狂犬病毒免疫球蛋白適宜稀釋度配制成包被液。每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于濕盒中37℃3小時(shí)，然后4℃過夜。取出倒空板，加300μl/孔封閉液，再用封口膜封好置于濕盒中37℃?1小時(shí)，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存。