[發(fā)明專利]一種改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210394118.8
• 申請日: 2012-10-17
• 公開（公告）號: CN102890040A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬文廣;姚恒;牛永志;鄭昀曄;索文龍;宋碧清;李元君
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;玉溪中煙種子有限責任公司
• 主分類號: G01N9/24
• 分類號: G01N9/24
• 代理公司: 昆明知道專利事務(wù)所(特殊普通合伙企業(yè)) 53116
• 代理人: 姜開俠;姜開遠

1.一種改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，包括蔗糖濃度梯度溶液配制、花粉樣品處理、花粉樣品鋪放、密度梯度離心液配制、離心沉降、繪制吸光度標準曲線、測定吸光度及花粉密度計算，具體包括：

A、蔗糖濃度梯度溶液配制：將蔗糖溶于水中，配制成質(zhì)量百分比分別為20~70%的溶液；

B、花粉樣品處理：將蔗糖溶于水中，配置成質(zhì)量百分比為10%的溶液，稱取0.001~0.01g待測花粉混合在100~1000μl?10%蔗糖溶液中；

C、花粉樣品鋪放：將含有花粉樣品的10%蔗糖溶液注入離心管底部；

D、密度梯度離心液配制：采用層鋪法將質(zhì)量百分比20~70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待測花粉樣品的10%蔗糖溶液的離心管底部，配置成密度梯度離心液；

E、離心沉降：在離心機中，20℃下，以4000~10000rpm速度，對含待測花粉樣品的密度梯度離心液離心5~15min，待花粉達到沉降平衡后靜置；

F、繪制吸光度標準曲線：選取花粉懸浮所在層相應(yīng)濃度的蔗糖溶液，繪制待測花粉在該相應(yīng)濃度的蔗糖溶液中的吸光度標準曲線；

G、測定吸光度值：取花粉沉降平衡后的密度梯度離心液，采用分光光度計在290?nm波長下，測定待測花粉懸浮層蔗糖溶液的吸光度值，利用標準曲線換算成該層濃度梯度下花粉的濃度值；

H：花粉密度計算：花粉的密度按照下列公式計算：

其中：

ρ——花粉的密度；

OD_n——第n層蔗糖梯度溶液中花粉濃度值；

OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉濃度值總和；

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度。

2.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟B所述的10%蔗糖溶液的用量100μl。

3.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟C、D所述的離心管容積為1.5~50ml。

4.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟D所述層鋪法是將質(zhì)量百分比分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液中的幾種，用注入器依次注入離心管，先將低濃度的蔗糖溶液注入已含有待測花粉的10%蔗糖溶液的離心管底部，然后吸取高濃度的蔗糖溶液，將注入器插入管底，加入高濃度的蔗糖溶液，待濃度高的蔗糖溶液將濃度低的蔗糖溶液頂至上層，將不同質(zhì)量百分比的蔗糖溶液按質(zhì)量百分比由低至高的順序，用上述方法依次加入，每次各50~200μl，制成密度梯度離心液。

5.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟E所述的離心機為Microfuge?22R離心機。

6.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟E所述的離心轉(zhuǎn)速4000rpm~10000?rpm。

7.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟E所述的離心時間為5min~20min。

8.如權(quán)利要求1所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：步驟F所述吸光度標準曲線的繪制，是選取待測花粉懸浮所在層相應(yīng)濃度的蔗糖溶液2ml，將0.01g待測花粉加入，待其懸浮穩(wěn)定后，用分光光度計測定吸光度值，然后等比稀釋，再次測定其吸光度值，根據(jù)所測得的吸光度值和花粉濃度，繪制吸光度標準曲線。

9.如權(quán)利要求1或8所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：所述分光光度計為UV-1800紫外分光光度計。

10.如權(quán)利要求8所述改良密度梯度離心法測定花粉密度的方法，其特征在于：所述吸光度標準曲線的繪制，含有待測花粉的蔗糖溶液，至少等比稀釋1倍以上。