[發(fā)明專利]一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210392585.7
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102899350A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳介南;盧孟柱;劉伯斌;王瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中南林業(yè)科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所 43114
• 代理人: 袁靖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用方法。?

背景技術(shù)

麻瘋樹是國際上研究最多的能生產(chǎn)生物柴油的能源植物之一，開展遺傳轉(zhuǎn)化能極大的促進麻瘋樹遺傳育種的研究。鑒于麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化工作難度大，目前國內(nèi)外關(guān)于這方面的報道還不是很多，而且已有研究用于麻瘋樹轉(zhuǎn)化的選擇標記系統(tǒng)都是采用潮霉素、卡拉霉素等抗生素或除草劑進行抗性篩選。這類藥物對植株轉(zhuǎn)化有較大影響，會影響轉(zhuǎn)化細胞的生長及再生，尤其是像麻瘋樹這類的木本植物，采用傳統(tǒng)的抗生素或除草劑等篩選方法獲得轉(zhuǎn)基因芽、再生根相當困難。另外，標記基因的安全性從一開始就受到了廣泛爭論。雖然也有不少手段可以去除轉(zhuǎn)基因植物中的標記基因。但大多效率不高，或者需要進行子代雜交，這對木本植物來說不是十分現(xiàn)實。隨著研究的不斷深入，甘露糖篩選體系作為一種新型正向的篩選方法已受到了越來越多的人的關(guān)注。該體系是以大腸桿菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因PMI為篩選標記基因，D-甘露糖為篩選劑進行篩選。1998年Joersbo小組報道了首例PMI轉(zhuǎn)基因甜菜，隨后對影響轉(zhuǎn)化效率的因素作了大量的研究。雖然PMI/甘露糖篩選體系研究歷史較短，僅有部分植物采用了該體系，但有由模式植物向經(jīng)濟作物發(fā)展的趨勢。對一些難生根的作物，尤其是木本植物，相對抗生素篩選而言，甘露糖篩選對轉(zhuǎn)基因芽生根能力的抑制要輕得多。2003年巴西的Boscariol等用帶有PMI基因的農(nóng)桿菌感染4種甜橙實生苗上胚軸，以甘露糖為碳源和篩選劑，其轉(zhuǎn)化率在3%~23.8%之間，表明了該體系的有效性和安全性。?

雖然PMI/甘露糖篩選體目前已成功用于甜菜、擬南芥、玉米、小麥、水稻、大麥等多種植物轉(zhuǎn)化，在木本植物甜橙和葡萄等上也有研究。但在麻瘋樹遺傳轉(zhuǎn)化中還尚未見報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用PMI（磷酸甘露糖異構(gòu)酶）/甘露糖篩選體系在麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用方法，以提高麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化的效率。?

為達到以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：?

一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用方法，依次包括以下步驟：?

1)克隆6磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因（該基因序列在ncbi上面公開），構(gòu)建甘露糖篩選標記的植物表達載體，并將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中；?

2）將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的麻瘋樹的葉盤外植體與農(nóng)桿菌在感染培養(yǎng)基中感染轉(zhuǎn)化，然后在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，再依次轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基、芽伸長培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。?

步驟1）所述的植物表達載體是雙元載體pC1304PMI，（由6磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因替換植物表達載體中的hpt基因）包含6磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因和GUS報告基因。?

步驟2）中麻瘋樹的葉盤外植體預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；SNP是Sodium?Nitroprusside（硝普鈉），TDZ是一種細胞分裂素，全稱是Thidiazuron。?

感染培養(yǎng)基：用MS液體培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，?

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：SR預(yù)培養(yǎng)基。?

步驟2）所述的篩選培養(yǎng)基：SR培養(yǎng)基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖為糖源，附加500mg/L頭孢霉素。?

步驟2）所述的芽伸長培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L頭孢霉素；?

生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L頭孢霉素。?

步驟2）中麻瘋樹的葉盤外植體的預(yù)培養(yǎng)過程如下：選取生長旺盛的麻瘋樹頂端幼嫩葉片，在無菌條件下用質(zhì)量濃度20%的NaClO溶液（有效氯濃度為2%）消毒20分鐘，無菌水洗滌三遍，切成大小為9mm²葉盤，近軸端朝上置于SR培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)14天，再進行感染轉(zhuǎn)化。?

所述的感染培養(yǎng)基的制備過程如下：通過電轉(zhuǎn)化法將載體pC1304PMI導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，將轉(zhuǎn)化細菌的單個菌落接種到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液體LB培養(yǎng)基中；在28℃下培養(yǎng)細菌生長直到OD600值達到0.6，得到農(nóng)桿菌菌液，然后用MS?液體培養(yǎng)基稀釋30倍，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，作為感染培養(yǎng)基。?