[發明專利]一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉化中的應用方法

有效

• 申請號: 201210392585.7
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102899350A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 陳介南;盧孟柱;劉伯斌;王瓊
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

1.一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉化中的應用方法，其特征在于，依次包括以下步驟：

1)克隆6磷酸-甘露糖異構酶基因，構建甘露糖篩選標記的植物表達載體，并將載體導入農桿菌中；

2）將經過預培養的麻瘋樹的葉盤外植體與農桿菌在感染培養基中感染轉化，然后在共培養培養基中共培養，再依次轉入篩選培養基、芽伸長培養基和生根培養基中進行培養，獲得轉基因植株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述的植物表達載體是雙元載體pC1304PMI，包含6磷酸-甘露糖異構酶基因和GUS報告基因。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟2）中麻瘋樹的葉盤外植體預培養的培養基：MS培養基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；

感染培養基：用MS液體培養基稀釋農桿菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，

共培養培養基：SR預培養基。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟2）所述的篩選培養基：SR培養基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖為糖源，附加500mg/L頭孢霉素。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟2）所述的芽伸長培養基：MS培養基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L頭孢霉素；

生根培養基：MS培養基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L頭孢霉素。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟2）中麻瘋樹的葉盤外植體的預培養過程如下：選取生長旺盛的麻瘋樹頂端幼嫩葉片，在無菌條件下用質量濃度20%的NaClO溶液消毒20分鐘，無菌水洗滌三遍，切成大小為9mm²葉盤，近軸端朝上置于SR培養基中預培養14天，再進行感染轉化。

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，

所述的感染培養基的制備過程如下：通過電轉化法將載體pC1304PMI導入根癌農桿菌GV3101中，將轉化細菌的單個菌落接種到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液體LB培養基中；在28℃下培養細菌生長直到OD600值達到0.6，得到農桿菌菌液，然后用MS液體培養基稀釋30倍，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，作為感染培養基。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中具體是將預培養后的葉盤浸泡于感染培養基中10分鐘，取出外植體，用滅菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將浸泡過的外植體接種到SR培養基中在25℃在黑暗條件下共培養2天，直至在培養基上看到菌斑。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，

將共培養后的外植體轉入篩選培養基，在25℃黑暗條件下培養三周，將得到的抗性芽從愈傷組織上轉移到芽伸長培養基進行抗性芽的拉長培育，當拉長的抗性芽高度達到2厘米時，轉入生根培養基中培養20天，得到轉化植株。