[發(fā)明專利]甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210391877.9
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102899282A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高三基;米爾科夫艾瑞克;樸鐘元;陳如凱;傅華英;付為林;林藝華;吳小斌
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物原生質(zhì)體的分離與純化方法，具體涉及一種甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

????植物原生質(zhì)體克服了細(xì)胞壁這一屏障，是植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)等理論研究的理想材料，而且在基因工程及作物改良新品種培育方面有著重要應(yīng)用前景。近年來，隨著植物分子生物學(xué)發(fā)展，原生質(zhì)體作為一個單細(xì)胞系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用在基因定位、基因表達(dá)調(diào)控、RNA沉默機(jī)理、細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機(jī)制等方面的研究。

甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的研究始于上世紀(jì)70年代，原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)和植株再生也獲得成功。但是，與模式植物煙草或擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體研究相比，甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體分離純化效果不盡理想，植株再生頻率很低，直至今日沒有長足發(fā)展。以甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體為受體材料，開展甘蔗轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)未見報道。本發(fā)明建立高效、快速的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離和純化方法，獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體可作為外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究的受體材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、簡便的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，克服現(xiàn)有甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體分離和純化方法存在質(zhì)量和數(shù)量上的不足的問題，為甘蔗外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究提供高質(zhì)量、高產(chǎn)量的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體。

本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。

????本發(fā)明的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，包括甘蔗愈傷組織培養(yǎng)、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、甘蔗原生質(zhì)體的分離和甘蔗原生質(zhì)體的純化；其特征在于操作步驟如下：

1、甘蔗愈傷組織培養(yǎng)

取消毒后的甘蔗心葉組織，無菌條件下切成1-2?cm厚的薄片，在MS3固體培養(yǎng)基上，28?℃暗培養(yǎng)1-2個月，每隔2周繼代1次；所述MS3固體培養(yǎng)基為：MS+0.5?g/L水解酪蛋白+3?mg/L?2,4-D+30?g/L蔗糖+6.0?g/L瓊脂粉；MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基（下同）；

2、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

將甘蔗胚性愈傷組織搗碎后，在MS3液體培養(yǎng)基中，28?℃暗培養(yǎng)2周，紗布過濾，濾液靜置10-15?min，吸取底部胚性愈傷組織培養(yǎng)液，于恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/秒，28?℃暗培養(yǎng)1-2月，每隔1周繼代1次，直至懸浮細(xì)胞系出現(xiàn)；所述MS3液體培養(yǎng)基：MS+0.5?g/L水解酪蛋白+3?mg/L?2,4-D+30?g/L蔗糖，去離子水補(bǔ)足1升；

3、甘蔗原生質(zhì)體的分離????

取步驟2的新鮮懸浮細(xì)胞分裝到50?mL離心管，100?g離心2?min；棄上清液，用酶解緩沖液清洗懸浮細(xì)胞后，100?g離心2?min；棄上清液，取懸浮細(xì)胞2-3克加入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用3?mL酶解反應(yīng)液酶解過夜，分離出甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體；所述酶解緩沖液：0.02?mol/L?MES+0.4?mol/L甘露醇+0.02?mol/L氯化鉀，pH?5.7；所述酶解反應(yīng)液：2?%纖維素酶+0.1?%果膠酶+0.01?mol/L氯化鈣+0.1?%牛血清蛋白，溶解于酶解緩沖液；在酶解反應(yīng)液中，各原料所占的百分比為各原料與酶解緩沖液的重量百分比；

????4、甘蔗原生質(zhì)體的純化

用無菌水清洗70?μm?孔徑的尼龍網(wǎng)，然后用W5溶液潤洗，取步驟3獲得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至10?mL離心管中，100?g離心2?min；棄上清液，冰浴的W5溶液懸浮原生質(zhì)體，100?g離心1?min；棄上清液后即為純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體，在電子顯微鏡下觀察，形態(tài)正常的原生質(zhì)體量達(dá)10⁶個/mL；所述W5溶液：2?mmol/L?MES+154?mmol/L?氯化納+125?mmol/L?氯化鈣+5?mmol/L?氯化鉀，pH?5.7。

本發(fā)明還保護(hù)利用上述方法分離與純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體在甘蔗轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明使用的所有化學(xué)試劑為分析純。

????本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，快速從甘蔗胚性愈傷組織培養(yǎng)獲得懸浮細(xì)胞系，并通過酶消解后分離純化獲得質(zhì)量高、數(shù)量足、均一性好的完整原生質(zhì)體，為甘蔗外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料。

附圖說明

圖1是分離純化后的甘蔗原生質(zhì)體，標(biāo)尺為0.2?μm。