[發明專利]甘蔗愈傷組織原生質體的分離與純化方法

無效

• 申請號: 201210391877.9
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102899282A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 高三基;米爾科夫艾瑞克;樸鐘元;陳如凱;傅華英;付為林;林藝華;吳小斌
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種甘蔗愈傷組織原生質體的分離與純化方法，包括甘蔗愈傷組織培養、甘蔗懸浮細胞培養、甘蔗原生質體的分離和甘蔗原生質體的純化；其特征在于操作步驟如下：

(1)?甘蔗愈傷組織培養

取消毒后的甘蔗心葉組織，無菌條件下切成1-2?cm厚的薄片，在MS3固體培養基上，28?℃暗培養1-2個月，每隔2周繼代1次；所述MS3固體培養基為：MS+0.5?g/L水解酪蛋白+3?mg/L?2,4-D+30?g/L蔗糖+6.0?g/L瓊脂粉；MS培養基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養基；

(2)?甘蔗懸浮細胞培養

將甘蔗胚性愈傷組織搗碎后，在MS3液體培養基中，28℃暗培養2周，紗布過濾，濾液靜置10-15?min，吸取底部胚性愈傷組織培養液，于恒溫搖床震蕩培養，轉速120轉/秒，28?℃暗培養1-2月，每隔1周繼代1次，直至懸浮細胞系出現；所述MS3液體培養基：MS+0.5?g/L水解酪蛋白+3?mg/L?2,4-D+30?g/L蔗糖，去離子水補足1升；

????(3)?甘蔗原生質體的分離????

取步驟（2）的新鮮懸浮細胞分裝到50?mL離心管，100?g離心2?min；棄上清液，用酶解緩沖液清洗懸浮細胞后，100?g離心2?min；棄上清液，取懸浮細胞2-3?g加入6孔的細胞培養板內，用3?mL酶解反應液酶解過夜，分離出甘蔗愈傷組織原生質體；所述酶解緩沖液：0.02?mol/L?MES+0.4?mol/L甘露醇+0.02?mol/L氯化鉀，pH?5.7；所述酶解反應液：2?%纖維素酶+0.1?%果膠酶+0.01?mol/L氯化鈣+0.1?%牛血清蛋白，溶解于酶解緩沖液；在酶解反應液中，各原料所占的百分比為各原料與酶解緩沖液的重量百分比；

????(4)?甘蔗原生質體的純化

????用無菌水清洗70μm孔徑的尼龍網，然后用W5溶液潤洗，取步驟（3）獲得的原生質體轉移至10?mL離心管中，100?g離心2?min；棄上清液，冰浴的W5溶液懸浮原生質體，100?g離心1?min；棄上清液后即為純化的甘蔗愈傷組織原生質體；所述W5溶液：2?mmol/L?MES+154?mmol/L?氯化納+125?mmol/L?氯化鈣+5?mmol/L?氯化鉀，pH?5.7。

2.由權利要求1的方法分離與純化的甘蔗愈傷組織原生質體在甘蔗轉基因瞬時表達中的應用。