[發明專利]基因共轉染技術建立的白血病小鼠模型及其制備方法

有效

• 申請號: 201210391137.5
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102864172A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 崔淑芳;湯球;趙善民;劉志學;余琛琳;孫偉;蔡麗萍;徐晨;袁衛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A01K67/027
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及ras突變體及AML1-ETO融合基因共轉染骨髓細胞移植建立白血病小鼠模型及其制備方法。

背景技術

急性骨髓性白血病（Acute?myeloid?leukemia,AML），是一種骨髓造血前體細胞異常增殖的血液惡性腫瘤，是白血病的一種。其特點是骨髓中不成熟白血球劇增，使得骨髓無法制造健康的血細胞。AML是成年人最常見的急性白血病，其發病率隨著人的年齡而增加。AML可以是原發性的，也可能是因為放射線暴露、致癌化學藥物暴露造成。目前治療方法主要以化療法殺死惡性增殖的癌細胞為主，為了更好的為治療提供新的策略，建立和人AML盡量接近的動物模型并以此研究確切的發病機制尤為迫切。

小鼠在遺傳學與造血系統等方面和人類十分相似，因此建立小鼠白血病模型以研究人類白血病的細胞分子生物學特性、生化免疫特征、病理生理改變、發病機制以及藥物治療和預后具有重要意義。較為常用的C57BL小鼠對白血病因子較敏感，而對化學致癌物誘導作用敏感性低，但全身經放射線照射后，淋巴瘤發生率可達90%～100%。因此C57BL小鼠在評價特定基因或者基因突變在白血病發生中的作用尤其適合。

通過全身輻照后，結合骨髓移植的方法修改供體骨髓中的基因，使外源的基因得以表達并在后續觀察其在白血病發病過程中的功能是新近出現的一種快速而便捷的探索新的基因和突變在AML發病中的方法，已經有報道成功的利用這個策略研究了例如N-ras，c-KIT等基因的突變對于AML的影響。

國內外的研究報道表明，N-ras^G12D突變比例高與白血病發病有較強的相關性，通過骨髓重建的小鼠模型驗證發現N-ras^G12D突變確實可以顯著的促進AML疾病發生及嚴重程度。K-ras基因是Ras家族的另一個重要成員，它與N-ras基因具有極高的同源性，并且有報道發現AML病人中也存在K-ras^G12D突變，這個突變發生的比例接近前者，但在AML發生中K-ras^G12D突變對于疾病的發生具有怎樣的影響目前尚無報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基因共轉染技術建立的白血病小鼠模型，本發明的另一目的是提供該白血病小鼠模型的制備方法。

本發明所采用的技術方案是，提供一種通過對于K-ras基因進行定點突變，經過病毒包裝后導入小鼠骨髓細胞中，而后與轉染AML1-ETO融合基因的骨髓細胞應用尾靜脈注射的方法共同移植建立白血病小鼠模型的方法注入C57BL小鼠體內，建立一種白血病小鼠模型。

本發明提供了一種白血病小鼠模型的制備方法，包括以下步驟：

一、K-ras突變體及AML1-ETO融合基因慢病毒載體的構建

設計K-ras突變引物如下：

通過PCR擴增目的基因，回收、酶切、連接至慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，進一步完成克隆篩選，測序正確后重新培養含有陽性目的克隆的菌液，提取質粒保存備用；

以Addgene公司購買的AML1-ETO融合基因的質粒為模板，引物設計如下：

PCR產生AML1-ETO（AML1/ETO）基因（基因序列參見文獻：Chou?FS,Wunderlich?M,Griesinger?A,Mulloy?JC:N-Ras(G12D)induces?features?of?stepwise?transformation?in?preleukemic?human?umbilical?cord?blood?cultures?expressing?the?AML1-ETO?fusion?gene.Blood?2011,117(7):2237-2240.），將擴增的目的基因亞克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒載體。

二、K-ras突變體及AML1-ETO融合基因慢病毒載體的包裝