[發(fā)明專利]基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210391137.5
• 申請(qǐng)日: 2012-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102864172A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔淑芳;湯球;趙善民;劉志學(xué);余琛琳;孫偉;蔡麗萍;徐晨;袁衛(wèi)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;A01K67/027
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型的制備方法，包括以下步驟：A、K-ras突變體及AML1-ETO融合基因慢病毒載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)K-ras突變引物如下：

K-Ras^G12D正向引物序列如SEQ?ID?NO:1所示，

K-Ras^G12D反向引物序列如SEQ?ID?NO:2所示，

通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因，回收、酶切、連接至慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，進(jìn)一步完成克隆篩選，測(cè)序正確后重新培養(yǎng)含有陽(yáng)性目的克隆的菌液，提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆茫?/p>

以Addgene公司購(gòu)買(mǎi)的AML1-ETO融合基因的質(zhì)粒為模板，引物設(shè)計(jì)如下：

AML1-ETO正向引物序列如SEQ?ID?NO:3所示，

AML1-ETO反向引物序列如SEQ?ID?NO:4所示，

PCR產(chǎn)生AML1-ETO基因，將擴(kuò)增的目的基因亞克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒載體；

B、K-ras突變體及AML1-ETO融合基因慢病毒載體的包裝

接種細(xì)胞16-20小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞接近飽和時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，病毒稀釋用培養(yǎng)液為polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基。第一天，細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)后，按照每孔8000細(xì)胞接種96孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，感染時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)至30～50％的融合密度；第二天，當(dāng)天轉(zhuǎn)染時(shí)，將病毒液用含有8ug/ml?polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，然后小心吸去96孔板中的培養(yǎng)基，輕輕混勻各管慢病毒稀釋液，各取100ul加入每孔細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度兩個(gè)重復(fù)，放入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；第三天，去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100ul的完全培養(yǎng)基；第五、六天，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)；

C、骨髓細(xì)胞分離及病毒感染情況監(jiān)測(cè)

斷頸處死小鼠，游離出小鼠的兩條下肢，剝離肌肉，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔，用無(wú)菌注射器輕輕插入骨髓腔，對(duì)準(zhǔn)一個(gè)無(wú)菌15ml離心管，將細(xì)胞沖出，然后離心，去上清；

離心沉淀下來(lái)的細(xì)胞用PBS沖洗，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算所需細(xì)胞體積數(shù)鋪板培養(yǎng)并接種于6孔板中，每孔加入K-ras突變體與AML1-ETO融合基因慢病毒的病毒懸液1～2ml，感染8h后離心收集細(xì)胞去上清，一部分種于96孔板中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用，96孔板中的細(xì)胞在培養(yǎng)24～48h后用熒光顯微鏡觀察并拍照；

D、感染細(xì)胞植入小鼠建立白血病動(dòng)物模型

取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后進(jìn)行8Gy輻照量的處理，輻照后部分小鼠尾靜脈注射0.5～1×10⁶小鼠骨髓細(xì)胞/只。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型的制備方法制備得到的一種白血病小鼠模型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白血病小鼠模型，其特征在于，該白血病小鼠模型具有以下性能：

A、骨髓細(xì)胞分型鑒定：

利用c-KIT，Gr-1，Mic-1的抗體對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其各組陽(yáng)性細(xì)胞的比例，從而確定AML的惡性程度，結(jié)果顯示存在大量GFP⁺/c-Kit⁺/Mac-1^-/Gr-1^-細(xì)胞，表明模型小鼠具有AML細(xì)胞分化比例的顯著表征；

B、分子水平鑒定：

對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了QPCR鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型小鼠的骨髓細(xì)胞中仍然具有前述的外轉(zhuǎn)K-ras基因，這說(shuō)明K-ras基因具有較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

C、蛋白水平的鑒定：

進(jìn)一步的Western?Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以上各種蛋白在模型小鼠骨髓中一直處于高表達(dá)狀態(tài)；

D、外周血細(xì)胞分型鑒定：

對(duì)外周血中的惡性腫瘤細(xì)胞的情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外周血的圖片中，經(jīng)過(guò)Wright-Giemsa染色后，發(fā)現(xiàn)存在許多早幼粒白血病細(xì)胞。