[發明專利]一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210390500.1
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102864243A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 黃明;何瑋玲;楊靜;徐幸蓮;周光宏
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于食品安全檢測領域，涉及的是食品中動物源性成分的快速檢測，具體涉及一種添加擴增內標的食品中豬肉、雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法。

背景技術

肉制品摻假是公眾關注的焦點問題之一。目前，肉類摻假主要表現在不法企業使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類，通過多種形式的深加工，冒充牛肉制品進行銷售，以謀取不當利益。摻假行為不僅侵犯了消費者的合法權益，而且極大打擊了公眾對于我國食品質量安全狀況的信心。因此，對于摻假牛肉制品中較常出現的豬肉和雞肉，建立科學、準確快速的檢測方法已十分必要。

以聚合酶鏈反應（PCR）為基礎的技術已逐步成為了食品中肉類種屬鑒定的核心方法。許多學者根據不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現食品中特征基因片段的指數級擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中可能的物種來源。近年來，實時熒光PCR技術的飛速發展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得肉類含量的定量溯源成為可能。在目標基因選擇方面，動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠保證檢測過程中不會出現物種間非特異性擴增而導致的交叉干擾；此外，目前對食品中動物源性的熒光定量PCR檢測研究均缺乏陽性擴增內標（IAC）對反應體系進行監控，無法避免檢測假陰性結果的產生，導致檢測結果不準確。目前國際上以細胞核基因DNA序列為目標基因，并添加有擴增內標的食品中動物源性熒光定量PCR檢測方法尚未見報道。因此，建立添加有擴增內標的食品中豬肉和雞肉的熒光定量PCR快速檢測方法將對食品安全的快速監管具有重要的創新性實踐意義。

發明內容

本發明從豬和雞細胞核基因中的物種特異性序列出發，探索并完善了快速檢測食品中豬肉和雞肉的Taqman熒光定量PCR檢測方法。

一種添加擴增內標的食品中豬肉和雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法，包括以下步驟：（1）應用根據豬的beta?actin基因及雞的transforming?growth?factor基因設計擴增引物和Taqman探針，分別使用熒光基團FAM、HEX作為探針的發光基團；（2）設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒并設計相應探針；（3）以含有待檢DNA模板、含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，陽性擴增內標DNA的Taqman探針，以及設計合成的豬beta?actin基因擴增引物和Taqman探針，或雞transforming?growth?factor基因擴增引物和Taqman探針的熒光定量PCR反應體系進行熒光定量PCR反應；（4）應用ABI?7500Software?SDS1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中步驟（2）所述的設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒的方法為：使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒有出現與之同源的DNA片段，在這段隨機DNA序列上、下游分別連接上目標物種的擴增引物序列，從而形成針對豬檢測體系和雞檢測體系長度分別為98bp和94bp的陽性擴增內標DNA序列；將這兩段擴增內標DNA序列委托人工基因合成，合成片段分別連接載體pGH，轉化感受態細胞DH5α，小量提取并測序驗證，得到分別針對豬肉和雞肉檢測體系的含有陽性擴增內標DNA的重組質粒。

本發明根據Genbank中豬的beta?actin基因（登錄號為DQ452569.1）和雞的transforming?growth?factor基因（登錄號為AY685072.1）設計了用于熒光定量PCR檢測的擴增引物和Taqman探針，分別使用熒光基團FAM、HEX作為探針的發光基團。引物與探針序列見表1。

表1熒光定量PCR引物與探針序列

本發明所述的陽性擴增內標是一種人工合成競爭型擴增內標，在體系中具有特異性探針并與靶基因共用一對引物，能有效指示假陰性出現同時降低了多對引物對熒光定量PCR體系產生干擾的風險；采用與靶基因同源性較低的擴增內標，使其不會與靶基因通過互補鏈的結合而交聯在一起而影響檢測靈敏度。