[發(fā)明專利]一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210390500.1
• 申請(qǐng)日: 2012-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102864243A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃明;何瑋玲;楊靜;徐幸蓮;周光宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）應(yīng)用根據(jù)豬的beta?actin基因或雞的transforming?growth?factor基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和Taqman探針，分別使用熒光基團(tuán)FAM、HEX作為探針的發(fā)光基團(tuán)；（2）設(shè)計(jì)構(gòu)建含有陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒并設(shè)計(jì)相應(yīng)探針；（3）以含有待檢DNA模板，含有陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒，陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的Taqman探針，以及設(shè)計(jì)合成的豬beta?actin基因擴(kuò)增引物和Taqman探針，或雞transforming?growth?factor基因擴(kuò)增引物和Taqman探針的熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；（4）應(yīng)用ABI?7500SoftwareSDS1.4對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，以Ct值小于36的擴(kuò)增作為檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果；其中步驟（2）所述的設(shè)計(jì)構(gòu)建含有陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒的方法為：使用DNA隨機(jī)生成軟件產(chǎn)生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒(méi)有出現(xiàn)與之同源的DNA片段，在這段隨機(jī)DNA序列上、下游分別連接上目標(biāo)物種的擴(kuò)增引物序列，從而形成針對(duì)豬檢測(cè)體系和雞檢測(cè)體系長(zhǎng)度分別為98bp和94bp的陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列；將這兩段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列委托人工基因合成，合成片段分別連接載體pGH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，小量提取并測(cè)序驗(yàn)證，得到分別針對(duì)豬肉和雞肉檢測(cè)體系的含有陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種添加有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的用于檢測(cè)食品中豬肉或雞肉成分的Taqman探針熒光定量PCR法，其特征在于：

豬beta?actin基因擴(kuò)增上游引物為SEQ?ID?NO.1，下游引物為SEQ?ID?NO.2，

探針為5’-FAM-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ?1-3’；

雞transforming?growth?factor基因擴(kuò)增上游引物為SEQ?ID?NO.3，下游引物為SEQ?ID?NO.4，

探針為5’-HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ?1-3’；

針對(duì)豬檢測(cè)體系的陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列：SEQ?ID?NO.5；

針對(duì)雞檢測(cè)體系的陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列：SEQ?ID?NO.6；

陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的Taqman探針為:5’-CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，其特征是，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系為：20μL反應(yīng)體系包含：模板DNA和含有陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒各2μL，Premix?Ex?Taq?10μL，靶基因探針溶液和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)探針溶液各0.4μM，ROX校正溶液0.4μL，豬和雞擴(kuò)增體系中引物濃度分別為0.2μM和0.6μM。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃30s，40個(gè)循環(huán)的95℃5s和60℃34s。

5.權(quán)利要求1所述的一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉、雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法在食品質(zhì)量控制和質(zhì)量安全檢測(cè)中的應(yīng)用。