[發明專利]豬傳染性胃腸炎TGE 的RT-LAMP檢測方法

有效

• 申請號: 201210390415.5
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102912037A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 賀東生;陳瑞愛;鐘望;劉好鵬;張顯浩;裴仉福;唐緒;湯欽
• 申請（專利權）人: 廣東大華農動物保健品股份有限公司;肇慶大華農生物藥品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

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技術領域

本發明適用于臨床和基層實驗室快速、準確地診斷豬傳染性胃腸炎。

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背景技術

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種高度接觸傳染性腸道疾病，臨床上以病豬嘔吐、嚴重腹瀉和失水為主要特征，不同品種、年齡的豬只都可感染發病，尤以兩周齡以內仔豬、斷奶仔豬易感性最強，致死率高，可達100%^[1]。該病是一種世界性疾病，給畜牧業生產帶來巨大的經濟損失，早發現、早確診對該病的防治意義重大。要做到早確診就需要快速、敏感、特異的診斷方法。

目前，檢測?TGEV?的常規方法主要有:?病原學檢測，包括：病毒的分離鑒定、電鏡檢測、免疫熒光法和免疫過氧化物酶法等；血清學檢測，包括血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）^[2]等；分子診斷技術，包括：核酸探針雜交技術^[3]、聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術^[4]、多重RT-PCR?和RT-nPCR方法等。

作為傳統的檢測方法，TGEV的病原學檢測存和血清學檢測在著許多問題。

TGEV的分離只能在實驗室進行，需要較高的技術水平和較先進的實驗條件，操作困難，所需周期長，且TGEV與多種病毒接種細胞后CPE相同或相似，如諸呼吸道冠狀病毒、豬流行性腹瀉等，因此病毒分離方法顯得并不可靠。病毒分離以后為了最終確認該豬組織中的病毒，還需借助其它得檢測手段,?如特異性抗TGEV血清做中和試驗、免疫熒光(IF)等方法進行最終的鑒定^[5]；通過電鏡觀察病毒證明，在感染豬腸內容物和糞便中可以發現有TGEV的存在^[6]。實踐證明免疫電鏡(IEM)比常規電鏡(EM)的檢測效果更好，前者對檢測臨床樣品或細胞培養物中的TGEV更為敏感，并可以提供病毒血清學的鑒定。但是最終還必須使用特殊的單克隆抗體檢測。雖然該兩種方法可以作為確診該病的最終診斷依據，但是成本高、過程復雜、操作時間長。

TGEV抗體的血清學方法檢測，最常用的是SN試驗，其中微量滴定板和抑制試驗和蝕斑減數試驗使用最為普遍^[7]。已經建立的間接熒光抗體試驗方法不如VN試驗的敏感和可靠^[8-9]。相對敏感的被動血凝試驗則需要濃縮純化病毒及致敏紅細胞。其他發展的血清學試驗包括：檢測免疫球蛋白特異性抗體的間接免疫過氧化物酶試驗、放射性免疫沉淀試驗和“似及對流免疫電泳”^[10-11]。但是，該實驗法存在嚴重的非特異性。

酶聯免疫吸附實驗?(ELISA)是當前應用最廣泛的一種免疫學檢測方法，己發展了間接ELISA、雙抗體夾心ELESA、競爭ELISA和阻斷ELISA等。不同的ELISA方法可檢測TGEV抗體或抗原。ELISA方法是常用檢測方法，但由于單克隆抗體是針對特定抗原位點，而不同TGEV株這些抗原位點有差異，導致某些樣品的漏檢^[12]。

分子診斷技術的蓬勃發展給TGEV的檢測提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技術^[13]、核酸序列依賴性擴增（NASBA）^[14]、實時熒光RT-PCR^[15]、錯配擴增突變試驗(?MAMA)?等，同樣，諸多新型核酸擴增技術法均存在不同的缺點，例如：試驗周期較長、操作繁瑣、靈敏度不高、特異性不強、準確性較低、易受檢測材料限制等^[16]，?應用于臨床鑒別診斷的實用意義不大^[17]，不適合在基層實驗室推廣應用^[18]。因此?，建立一種快速簡便的、適用于臨床和基層實驗室的檢測方法十分重要。

環介導等溫核酸擴增技術（LAMP）最初是Notomi等^[19]?設計并應用于病毒及其他病原體基因的檢測，其特點是針對靶基因的不同區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)，于恒溫條件下幾十分鐘內即可完成核酸的擴增反應,?具有較高的敏感性和特異性。逆轉錄環介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）是在LAMP反應體系中加入一定量的逆轉錄酶從而實現RNA到DNA的一步擴增。