[發(fā)明專利]豬傳染性胃腸炎TGE 的RT-LAMP檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210390415.5
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102912037A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀東生;陳瑞愛;鐘望;劉好鵬;張顯浩;裴仉福;唐緒;湯欽
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司;肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.豬傳染性胃腸炎TGE?的RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

1）根據(jù)GenBank中TGEV?N基因的保守區(qū)域，用在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物如下：?

?FIP??5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’

BIP?5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’

F3????5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’

B3????5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；

2）用常規(guī)方法將PK-15細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待其長成單層，將TGEV?Purdue株凍干毒用DMEM稀釋后接種于細(xì)胞上，在37℃，5%?CO2?培養(yǎng)箱中吸附1h后，棄病毒液，加入DMEM維持液，重新置于37℃，5%?CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，刮取細(xì)胞收獲病毒液，-80℃?zhèn)溆茫?/p>

3）提取?TGEV的RNA；

4）以步驟3)所得的TGEV的RNA為模板，按照下述條件進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)：

10×Bst?buffer?2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst?DNA?聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl2?（25mmol/L）0.5μL、MgSO4（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs?（10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去離子水補(bǔ)足25μL；反應(yīng)條件為：62℃1h，80℃10min；

5）?可視化觀察RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果;

6）瓊脂糖凝膠驗(yàn)證可視化RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果。

2.如權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎TGE?的RT-LAMP檢測方法，其特征在于，步驟3）提取?TGEV的RNA的方法為：

3-1?)用移液器將20μL蛋白酶K加入一個(gè)干凈的1.5?mL離心管中;

3-2)?向離心管中加入200μL步驟2）獲得的病毒液；

3-3)加入200μL?Carrier?RNA工作液蓋上管蓋，渦旋振蕩15秒混勻；為了保證裂解充分，樣品和Carrier?RNA工作液需要徹底混勻；Carrier?RNA工作液為緩沖液GB與Carrier?RNA溶液的混合液，配制方法按照公式計(jì)算,?配制公式為：

n×0.22mL=y?mL?????????mL×28?uL/mL=zμL

n=同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù)

y=需要加入緩沖液GB的體積

z=需要加入Carrier?RNA

3-4)?在56℃孵育15分鐘；簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；

3-5)?加入250μL無水乙醇，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒，在15-25℃放置5分鐘；如果周圍環(huán)境高于25℃，乙醇需要再在冰上預(yù)冷后再加入；

3-6)?簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；

3-7)?將RNase-free吸附柱CR2放在收集管中，仔細(xì)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至RNase-free吸附柱CR2，蓋上管蓋，8000?rpm（~6000?x?g)離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；

3-8)小心打開吸附柱蓋子，加入500μL溶液RW，蓋上管蓋，靜置2分鐘，8000?rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管；

3-9)?重復(fù)3-8)步驟一次；

3-10)小心打開吸附柱蓋子，加入500μL無水乙醇，蓋上管蓋，8000?rpm離心1分鐘，棄廢液；

3-11)將吸附柱放回收集管中，12,000?rpm離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液；

3-12)?將吸附柱放入一個(gè)RNase-free的1.5?ml離心管中，小心打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入20-150ul?RNase-free?ddH20，蓋上蓋子，室溫放置5分鐘12,000?rpm離心1分鐘;離心結(jié)束后，離心管中收集液即為TGEV病毒基因組RNA。