[發(fā)明專利]肺炎鏈球菌多重降落PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210387026.7
• 申請(qǐng)日: 2012-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN102888460A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵世和;侯艷嬌;羅欲承;邵晨;管賢偉;丁杰;唐國建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌感染的分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多重降落PCR?檢測(cè)方法在下呼吸道標(biāo)本中肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

???肺炎鏈球菌又名肺炎球菌，是社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的主要病原體，培養(yǎng)要求較高。易發(fā)生肺炎鏈球菌肺部感染的高危人群有：免疫缺陷者、呼吸道病毒感染后、嬰幼兒、年老體弱者。肺炎鏈球菌是慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者發(fā)生CAP的主要病因，此外肺炎鏈球菌還可引起腦膜炎、中耳炎及膿毒血癥等疾病。

Corless,?C.E等（Corless,?C.E.,?et?al.,?Simultaneous?detection?of?Neisseria?meningitidis,?Haemophilus?influenzae,?and?Streptococcus?pneumoniae?in?suspected?cases?of?meningitis?and?septicemia?using?real-time?PCR.?J?Clin?Microbiol,?2001.?39(4):?p.?1553-8.）建立了以ply基因?yàn)榘袠?biāo)檢測(cè)肺炎鏈球菌的實(shí)時(shí)PCR，支持ply基因?yàn)榉窝祖溓蚓逃?。Murdoch,?D.R報(bào)道了以ply基因?yàn)榘袠?biāo)建立的PCR可將部分甲型溶血性鏈球菌誤鑒定為肺炎鏈球菌（Murdoch,?D.R.,?Molecular?genetic?methods?in?the?diagnosis?of?lower?respiratory?tract?infections.?APMIS,?2004.?112(11-12):?p.?713-27.）同時(shí)針對(duì)肺炎鏈球菌的多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)可提高檢測(cè)方法的特異性。Korbie,?D.J.等（Korbie,?D.J.?and?J.S.?Mattick,?Touchdown?PCR?for?increased?specificity?and?sensitivity?in?PCR?amplification.?Nat.?Protocols,?2008.?3(9):?p.?1452-1456.）發(fā)現(xiàn)降落PCR可提高PCR的特異性與靈敏度。當(dāng)前尚無同時(shí)針對(duì)肺炎鏈球菌recA、ply、16S?rRNA基因以檢測(cè)肺炎鏈球菌的多重PCR報(bào)道。本發(fā)明建立的多重降落PCR可直接檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中的肺炎鏈球菌，費(fèi)時(shí)少，具高度特異性與靈敏性，有利于肺炎鏈球菌感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可快速特異檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中肺炎鏈球菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)發(fā)案實(shí)現(xiàn)的：

一種肺炎鏈球菌多重降落PCR檢測(cè)試劑盒，包括：10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP，Taq?DNA聚合酶，BSA，肺炎鏈球菌陽性對(duì)照DNA，3對(duì)肺炎鏈球菌引物；

所述3對(duì)肺炎鏈球菌引物對(duì)序列如下：

第1對(duì)：

SP_recA-F：5’-?CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC?-3’（SEQ?ID?NO.1）

SP_recA-R：5’-?CAGACTCAGGAGAGCAAGGT?-3’（SEQ?ID?NO.2）；

第2對(duì)：

SP_ply-F：5’-?GCCTCTATCCTGGAGCACTT?-3’（SEQ?ID?NO.3）

SP_ply-R：5’-?AGCAGCCTCTACTTCATCACT?-3’（SEQ?ID?NO.4）；

第3對(duì)：

SP_16S?rRNA-F?：5’-?CTGTGGCTTAACCATAGTAG?-3’（SEQ?ID?NO.5）

SP_16S?rRNA-F:?5’-?CTAGCACTCATCGTTTACA?-3’（SEQ?ID?NO.6）。

本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述試劑盒的檢測(cè)方法：

（一）????提取待檢樣本DNA

（二）????多重降落PCR法擴(kuò)增檢測(cè)待檢樣本DNA中的recA、ply、16S?rRNA基因，具體步驟如下：