[發明專利]肺炎鏈球菌多重降落PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201210387026.7
• 申請日: 2012-10-12
• 公開（公告）號: CN102888460A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 邵世和;侯艷嬌;羅欲承;邵晨;管賢偉;丁杰;唐國建
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種肺炎鏈球菌多重降落PCR檢測試劑盒，包括：10×PCR緩沖液，MgCl₂，dNTP，Taq?DNA聚合酶，BSA，肺炎鏈球菌陽性對照DNA，3對肺炎鏈球菌引物；所述3對肺炎鏈球引物為：

SP_recA-F：5’-?CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC?-3’

SP_recA-R：5’-CAGACTCAGGAGAGCAAGGT?-3’

SP_ply-F：5’-?GCCTCTATCCTGGAGCACTT?-3’

SP_ply-R：5’-?AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’

SP_16S?rRNA-F：5’-?CTGTGGCTTAACCATAGTAG?-3’

SP_16S?rRNA-R：5’-?CTAGCACTCATCGTTTACA?-3’。

2.一種肺炎鏈球菌多重降落PCR檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

(1)提取待檢樣本DNA

(2)多重PCR法擴增檢測待檢樣本DNA中的recA、ply、16S?rRNA基因，具體步驟如下：

反應體系：25?μl，包括H₂O?9.05?μl，緩沖液（10×PCR）2.5?μl，?BSA(10?mg/ml)?0.25?μl，SP_recA-F（10?μmol/L）3?μl，SP_recA-R（10?μ?mol/L）3μl，SP_ply-F（10?μmol/L）?0.25?μl，SP_ply-R：（10?μmol/L）0.25?μl，SP?_16S?rRNA-F（10?μmol/L）0.5?μl，SP?_16S?rRNA-R（10?μmol/L）?0.5?μl，MgCl₂(25?mM)3?μl，dNTP(10?mM)?0.5?μl，Taq?DNA聚合酶（5?U/μl）0.2?μl，DNA?模板?2?μl

3對肺炎鏈球引物為：

??SP_recA-F：5’-?CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC?-3’

??SP_recA-R：5’-CAGACTCAGGAGAGCAAGGT?-3’

??SP_ply-F：5’-?GCCTCTATCCTGGAGCACTT?-3’

??SP_ply-R：5’-?AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’

??SP_16S?rRNA-F：5’-?CTGTGGCTTAACCATAGTAG?-3’

??SP_16S?rRNA-R：5’-?CTAGCACTCATCGTTTACA?-3’

(3)PCR反應循環參數如下：

94?℃?5min；94?℃?30s,?65?℃?(每循環降低0.5?℃)?30?s,?72?℃?1?min，20個循環；94?℃?30s,?55?℃?30s,?72?℃?1?min,?20?個循環；72?℃?7?min

(4)電泳檢測鑒定：

對多重降落PCR反應產物進行瓊脂糖電泳檢測，如電泳圖中含有217?bp、581?bp、735?bp條帶中的2條或3條則代表檢出肺炎鏈球菌。