[發明專利]用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法

有效

• 申請號: 201210385102.0
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN103725762A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 杜洪忠;吳品珊
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術，具體地說，涉及一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法。

背景技術

冬生疫霉（Phytophthora?hibernalis?Carne）是導致柑橘褐腐疫病的主要病原菌之一，柑橘褐腐疫病在果實采收前、采收后發生均可造成重大的經濟損失，尤其是在雨季。該病菌在澳大利亞西部的柑橘果實上首次被發現，隨后在歐洲、美洲及非洲等許多國家均有報道。該病菌主要侵染柑橘屬植物的果實和枝葉，還可侵染杜鵑、玫瑰、紅花、芝麻、番茄、蘋果等多種植物，導致植物出現枯萎、根腐或潰瘍癥狀。

因此開發冬生疫霉的早期快速檢測技術，對相關植物生產中的病害防控和無公害化具有重要的意義。

近年來，實時熒光定量PCR（熒光RT-PCR）技術及其相關分子檢測技術已廣泛用于植物病原菌消長動態的分子檢測與預警，然而國內外鮮有利用熒光RT-PCR技術檢測冬生疫霉方面的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針。

本發明的另一目的是提供用于檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法。

為了實現本發明目的，本發明的一種用于檢測冬生疫霉的引物對，其包括上游引物PH-F：5’-CGACTTGCCACCGGGA-3’（SEQ?IDNo.1）和下游引物PH-R：5’-AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’（SEQ?ID?No.2）。

本發明還提供含有上述引物對PH-F和PH-R的用于檢測冬生疫霉的試劑盒。

本發明還提供一種用于檢測冬生疫霉的探針，所述探針為：5’-F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3'（SEQ?ID?No.3），其中F1為報告熒光基團，Q1為非熒光性的淬滅基團。優選F1為FAM熒光染料，Q1為MGB。

本發明還提供一種檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法：以樣品DNA為模板，采用引物對PH-F和PH-R以及上述探針進行熒光RT-PCR反應，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。

上述熒光RT-PCR擴增反應中，25μL的反應體系含有成分如下：樣品DNA?1μL(0.0005-50ng)，10×PCR反應緩沖液（不含Mg²⁺）2.5μL，25mM?MgCL₂?2.0μL，2.5mM?dNTP?2.0μL，10μM引物PH-F?1μL，10μM引物PH-R?1μL，10μM探針1.5μL，5U/μL?Taq?DNA聚合酶0.3μL，ddH₂O?13.7μL。

熒光RT-PCR擴增反應過程中使用的退火溫度為60℃。優選地，反應程序為：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40個循環。

本發明還提供用于檢測冬生疫霉的試劑盒，其包括引物對PH-F和PH-R以及上述探針。

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的一種或多種。

更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發明在測序分析冬生疫霉及其近似種和近緣種的ITS序列的基礎上，分別設計用于檢測冬生疫霉的引物對和熒光探針。該探針與普通的Taqman探針不同之處在于3'端采用了非熒光性的淬滅基因，即淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發光，大大降低了本底信號的干擾。

Taqman?MGB探針技術，即將報告熒光染料標記在探針的5’端，而3'端采用了非熒光性的淬滅基因，二者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發射的熒光可被淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅基團的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現對冬生疫霉的檢測。

本發明根據冬生疫霉ITS序列，設計出可快速檢測冬生疫霉病菌的特異性引物對和探針，并在此基礎上建立了熒光RT-PCR檢測法，可從發病植物組織及土壤中復雜的病原菌環境快速、準確地檢測出冬生疫霉。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對冬生疫霉疫情的早期預警、疫區的病原監測以及進出口安全等方面具有重要意義。

附圖說明