[發(fā)明專利]融合串聯(lián)抗菌肽及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210382354.8
• 申請(qǐng)日: 2012-10-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102863539A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮興軍;李仲玉;程寶晶;李靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗菌肽及其制備方法。

背景技術(shù)

抗菌肽是生物體在免疫病原體刺激下，免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性的小分子多肽，是動(dòng)植物非特異免疫系統(tǒng)的重要成分，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、高等植物、昆蟲(chóng)、兩棲類、哺乳動(dòng)物以及人類體內(nèi)?？咕木哂锌咕⒖共《?、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。和抗生素相比，抗菌肽具有分子質(zhì)量小、抗菌譜廣、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無(wú)免疫原性和作用機(jī)制獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，不易引起微生物的耐藥性，被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌物。

Fowlicidin-2是在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種新型陽(yáng)離子抗菌肽，由31個(gè)氨基酸殘基組成，具有廣譜的抗菌活性，具有脂多糖(LPS)結(jié)合活性及免疫調(diào)節(jié)功能。與多數(shù)抗菌肽不同的是Fowlicidin-2具有很強(qiáng)的鹽離子耐受性，抗菌活性不受生理鹽濃度的影響，甚至在NaCl濃度為150mmol/L時(shí)，仍然保持著抗菌活性，對(duì)抗性菌株仍然有很強(qiáng)的抑制作用，這意味著Fowlicidin-2在抗感染治療應(yīng)用上有著很大的潛力。

天蠶素B(CecropinR)是由Boman從天蠶體內(nèi)分離得到的殺菌活性多肽，由37個(gè)氨基酸殘基組成，其N端堿性很強(qiáng)，形成雙親α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有廣譜的抗菌作用，具有較好的熱穩(wěn)定性，能選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)不良影響。

CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)是由天蠶素A的1-8位氨基酸殘基和蜂毒素的1-18位氨基酸殘基組成的雜合分子，氨基端為天蠶素部分，羧基端為蜂毒素部分，此雜合分子具有較2個(gè)單獨(dú)親本更廣的抗菌譜，同時(shí)去除了蜂毒素的溶血作用，拓寬了的抗菌譜。除抗菌能力外，還具有殺傷癌變細(xì)胞和包被的病毒、促進(jìn)傷口愈合等功能。

死亡素(Thanatin)，又稱死亡肽，是在昆蟲(chóng)斑腹刺益蝽(Podisus?maculiventris)中發(fā)現(xiàn)的，是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的抗菌譜最廣的抗菌肽之一。由21個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)G⁺、G^-和某些真菌都有抑制作用，但是對(duì)酵母影響不大，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也不表現(xiàn)出溶血性。

抗菌肽的制備主要有生物材料提取法、化學(xué)合成法和基因工程表達(dá)法三種。由于抗菌肽在生物組織中含量低、分離困難，除少數(shù)幾種昆蟲(chóng)抗菌肽外，提取法制得的樣品難以滿足應(yīng)用需要，僅適用于氨基酸序列分析和初步的抗菌試驗(yàn)。化學(xué)合成法分為液相合成法、固相合成法、片段合成法等等，都需要用到大量的化學(xué)制劑，存在成本高、工藝繁瑣的缺陷。采用基因工程的方法重組表達(dá)抗菌肽是目前比較理想的抗菌肽生產(chǎn)手段，但是由于抗菌肽分子量太小，在表達(dá)過(guò)程中的翻譯和轉(zhuǎn)錄時(shí)容易酶解，出現(xiàn)表達(dá)量低或者很難表達(dá)的問(wèn)題。而且與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性尚待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有抗菌肽合成方法中產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；特別是采用基因工程重組表達(dá)抗菌肽過(guò)程中抗菌肽分子容易被酶解，導(dǎo)致表達(dá)量低或者很難表達(dá)的問(wèn)題，而提出的融合串聯(lián)抗菌肽及其制備方法。

融合串聯(lián)抗菌肽由Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯(lián)而成，F(xiàn)owlicidin-2、天蠶素B、Cecropin?A(1-8)-Melittin(1-18)與死亡素之間用GlySerGly聯(lián)接。

本發(fā)明融合串聯(lián)抗菌肽由124個(gè)氨基酸組成，根據(jù)Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)與死亡素聯(lián)接順序的不同共有24種組合。

融合串聯(lián)抗菌肽按以下步驟制備：

一、融合串聯(lián)抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯(lián)而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯(lián)接，再根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)融合串聯(lián)抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點(diǎn)的三個(gè)密碼子，在融合串聯(lián)抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho?I和Xbal?I粘性末端，連接pUC59，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pUC57-TM；

二、用Xho?I和Xbal?I雙酶切pUC57-TM，獲得融合串聯(lián)抗菌肽的編碼基因片段，與pPICZαC連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH?5α，PCR和測(cè)序進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαC-TM；