[發明專利]融合串聯抗菌肽及其制備方法

無效

• 申請號: 201210382354.8
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN102863539A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 馮興軍;李仲玉;程寶晶;李靜
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.融合串聯抗菌肽，其特征在于融合串聯抗菌肽由Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四種抗菌肽串聯而成，Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)與死亡素之間用GlySerGly聯接。

2.根據權利要求1所述的融合串聯抗菌肽的制備方法，其特征在于融合串聯抗菌肽按以下步驟制備：

一、融合串聯抗菌肽由四種原始小分子抗菌肽串聯而成，四種原始小分子抗菌肽之間用GlySerGly聯接，再根據畢赤酵母密碼子偏愛性設計融合串聯抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串聯抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位點的三個密碼子，在融合串聯抗菌肽cDNA片段3’端加入終止密碼子TAA，再在5’和3’端分別引入Xho?I和Xbal?I粘性末端，連接pUC59，構建了克隆質粒pUC57-TM；

二、用Xho?I和Xbal?I雙酶切pUC57-TM，獲得融合串聯抗菌肽的編碼基因片段，與pPICZαC連接，轉化大腸桿菌DH?5α，PCR和測序進一步鑒定，構建重組表達載體pPICZαC-TM；

三、將重組表達載體pPICZαC-TM經Sac?I線性化后，電轉入畢赤酵母SMD1168中，用100μg/mL濃度的博萊霉素Zeocin和PCR法篩選獲得高拷貝的重組酵母轉化子；

四、將重組酵母轉化子的單菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基中，在30℃、280r/min的條件下培養16～17h，然后取培養液轉接到BMGY培養基中，在30℃、300r/min條件下培養到OD值為2～6，收集菌體轉接于BMMY培養基中，在30℃、300r/min、1％甲醇的條件下誘導72h，在誘導過程中每隔24h補加甲醇保持終濃度為0.5％～1％；誘導后離心收集上清液，蛋白純化系統純化獲得融合串聯抗菌肽；

步驟一中四種原始小分子抗菌肽為Fowlicidin-2、天蠶素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素。

3.根據權利要求2所述的融合串聯抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中Kex2裂解位點的三個密碼子所編碼的氨基酸序列為GluLysArg，三個密碼子的堿基序列為GAGAAGAGA。

4.根據權利要求3所述的融合串聯抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中根據畢赤酵母密碼子偏愛性設計Fowlicidin-2的基因序列為CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC；根據畢赤酵母密碼子偏愛性設計天蠶素B的基因序列為AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根據畢赤酵母密碼子偏愛性設計Cecropm?A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列為AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGG℃TGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根據畢赤酵母密碼子偏愛性設計死亡素的基因序列為GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

5.根據權利要求4所述的融合串聯抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中聯接第一個和第二個原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGC；聯接第二個和第三個原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGCTCCGG％聯接第三個和第四個原始小分子抗菌肽的GlySerGly的堿基序列為GGTTCTGGT。

6.根據權利要求2、3、4或5所述的融合串聯抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一中5’端引入Xho?I粘性末端序列為CTCGAG，3’端引入Xbal?I粘性末端序列為TCTAGA。