[發(fā)明專(zhuān)利]一種3’-cDNA展示方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210382040.8
• 申請(qǐng)日: 2012-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102994632A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈定洪;鄭林用;彭衛(wèi)紅;甘炳成;黃忠乾;譚偉;王波;謝麗源
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種3’-cDNA展示方法。

背景技術(shù)

對(duì)不同生物不同發(fā)育階段的基因表達(dá)狀況進(jìn)行遺傳分析,可以為研究生命活動(dòng)過(guò)程提供十分重要的信息,?研究基因在特定時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)及表達(dá)豐度等情況。目前已有多種可在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)差異表達(dá)基因篩選分析的方法,如DDRT-PCR、cDNA-AFLP和SSH等。但冗余度、假陽(yáng)性高等問(wèn)題依然制約著這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

mRNA差異顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(?differential?display?of?mRNA?reverse?transcription?polymerase?chain?reaction,DDRT?PCR)?,是由Liang等首先建立的。此技術(shù)是以PCR技術(shù)和聚丙烯凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合銀染或放射性自顯影等顯色技術(shù),能快速有效地鑒定并克隆兩個(gè)或多個(gè)平行材料之間的差異表達(dá)基因,在植物研究方面已經(jīng)取得了很多成果。

現(xiàn)有技術(shù)一的缺點(diǎn)是假陽(yáng)性高,效率較低。

cDNA-AFLP是Bachem等在一種應(yīng)用于基因組DNA的選擇性擴(kuò)增限制性片段即(?Amplified?Fragment?Length?Polymorphism,AFLP)?的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出來(lái)的用于RNA指紋分析的方法。它將RT2PCR和AFLP結(jié)合起來(lái),由于PCR中使用較高的退火溫度和應(yīng)用特定引物對(duì)包含信息較多的內(nèi)部特異片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,增加了反應(yīng)條件的嚴(yán)謹(jǐn)度,使其比DDRT-PCR的可靠性和可重復(fù)性大大提高。

SSH的基本原理是利用消減雜交和兩次抑制PCR,使差異表達(dá)基因的cDNA片段得到高度富集,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)差異表達(dá)基因的分離和克隆。消減雜交運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理,即豐度高的單鏈cDNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA,從而在雜交過(guò)程中,使豐度高的單鏈cDNA雜交形成雙鏈,在雜交完畢后,原來(lái)在豐度上有差別的單鏈cDNA達(dá)到均一化的目的。抑制PCR是利用DNA鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火,且比鏈間退火更穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性,使非目的系列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似“鍋柄”的結(jié)構(gòu),無(wú)法與引物配對(duì)不能擴(kuò)增,從而選擇性富集目的基因序列片段。

現(xiàn)有技術(shù)二的缺點(diǎn)是無(wú)法處理多個(gè)樣本多個(gè)時(shí)期的mRNA差異表達(dá)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種3’-cDNA展示方法，旨在解決假陽(yáng)性高,效率較低，無(wú)法處理多個(gè)樣本多個(gè)時(shí)期的mRNA差異表達(dá)研究的問(wèn)題。

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種3’-cDNA展示方法，其特征在于，該方法的主要步驟包括：

(1)以總RNA?或者mRNA?為模板，以設(shè)計(jì)合成的Oligo?(dT)₁₈V引物通反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；

(2)將步驟(1)得到產(chǎn)物通過(guò)TaqⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；

(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計(jì)合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接；

(4)以O(shè)ligo?(dT)₁₈V及TaqⅠ“Y”形接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

進(jìn)一步，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法進(jìn)一步包括：

(1)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計(jì)合成的Oligo?(dT)₁₈V引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；

(2)將步驟(1)得到產(chǎn)物通過(guò)TaqⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；

(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計(jì)合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產(chǎn)物，一種是兩端都連接上“Y”形接頭的片段，另一種是一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；

(4)以O(shè)ligo?(dT)₁₈V及TaqⅠ“Y”形接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果是：兩端都連接上“Y”形接頭的片段在PCR擴(kuò)增中因其片段兩尾的互補(bǔ)序列而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增受到抑制；而一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴(kuò)增中得到正常指數(shù)擴(kuò)增。

進(jìn)一步，所述展示方法應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴(kuò)增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴(kuò)增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴(kuò)增cDNA?3’末端序列。