[發(fā)明專利]一種3’-cDNA展示方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210382040.8
• 申請(qǐng)日: 2012-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN102994632A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈定洪;鄭林用;彭衛(wèi)紅;甘炳成;黃忠乾;譚偉;王波;謝麗源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種3’-cDNA展示方法，其特征在于，該方法的主要步驟包括：

(1)以總RNA?或者mRNA?為模板，以設(shè)計(jì)合成的Oligo?(dT)₁₈V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；

(2)將步驟(1)得到產(chǎn)物通過TaqⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；

(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計(jì)合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接；

(4)以O(shè)ligo?(dT)₁₈V及TaqⅠ“Y”形接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

2.如權(quán)利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法進(jìn)一步包括：

(1)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計(jì)合成的Oligo?(dT)₁₈V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；

(2)將步驟(1)得到產(chǎn)物通過TaqⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；

(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計(jì)合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產(chǎn)物，一種是兩端都連接上“Y”形接頭的片段，另一種是一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；

(4)以O(shè)ligo?(dT)₁₈V及TaqⅠ“Y”形接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果是：兩端都連接上“Y”形接頭的片段在PCR擴(kuò)增中因其片段兩尾的互補(bǔ)序列而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增受到抑制；而一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴(kuò)增中得到正常指數(shù)擴(kuò)增。

3.如權(quán)利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述展示方法應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴(kuò)增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴(kuò)增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴(kuò)增cDNA?3’末端序列。