[發(fā)明專利]一種分離純化小膠質(zhì)細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210380987.5
• 申請日: 2012-10-09
• 公開（公告）號: CN103710306A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛穎;葉紅星;姚瑜;岳琪;莫鏈杰;張新;周良輔
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，涉及一種分離純化小膠質(zhì)細胞的方法，尤其涉及從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞的方法；該方法結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過免疫磁珠標(biāo)記CD11b從新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞，并在體外培養(yǎng)擴增，為小膠質(zhì)細胞與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系研究提供基礎(chǔ)。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開了目前腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其具有生存期短、復(fù)發(fā)率及死亡率高等特點。有統(tǒng)計顯示，腦腫瘤是實體瘤患兒死亡的首要疾病，膠質(zhì)瘤占兒童腫瘤構(gòu)成比的1/5左右，成人膠質(zhì)瘤占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的50%～60%。盡管近年來的綜合治療（包括手術(shù)、放療、化療）取得了進步，但膠質(zhì)母細胞瘤2年的生存率為27.2%，5年僅為9.8%。由于免疫治療具有抗腫瘤的精確性和可持續(xù)性等可能的潛在優(yōu)勢，故近年來對膠質(zhì)瘤免疫逃逸機制及免疫治療的研究成為膠質(zhì)瘤應(yīng)用基礎(chǔ)研究中發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。

小膠質(zhì)細胞（Microglia）是膠質(zhì)瘤組織中浸潤的主要免疫細胞。有研究采用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中約1/3的細胞表達小膠質(zhì)細胞的標(biāo)記（CD11b/c），其遠遠超過了膠質(zhì)瘤組織中其他免疫細胞的數(shù)量。所述小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天性和獲得性免疫反應(yīng)相關(guān)，在生理條件下，小膠質(zhì)細胞呈分枝狀并一直監(jiān)視其周圍的微環(huán)境，一旦被激活，其將對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷做出反應(yīng)并分泌炎性因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，吞噬受損的細胞及碎片，乃至呈遞抗原。

基于小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理中的重要作用，最近有若干研究關(guān)注于人小膠質(zhì)細胞的分離，以便探索其在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用；然而，目前大多數(shù)的分離方法都花費相當(dāng)多的時間用生長因子（如M-CSF、GM-CSF）刺激培養(yǎng)細胞；其中，Gibbons等認(rèn)為，若要獲得理想的純度和質(zhì)量，勢必要從分子生物學(xué)的角度分析小膠質(zhì)細胞的表型（Int?J?Biochem?Cell?Biol，2010，42:844–856）；Dick和Hussain分別于1997年和2006年介紹了從新鮮組織中分離小膠質(zhì)細胞的方法，但是并未涉及小膠質(zhì)細胞的分離純度（AIDS，1997，11:1699–1708；Neuro?Oncol，2006a,8:261–279）；2010年，Adam?Wu采用Percoll密度梯度離心法分離人腦膠質(zhì)瘤組織中的小膠質(zhì)細胞（Neuro?Oncol，2010,12（11）：1113-1125）。新近，荷蘭科學(xué)家Marta等提供了從尸體腦組織中分選小膠質(zhì)細胞的途徑，并且也采用了percoll密度梯度離心聯(lián)合磁珠分選的辦法（GLIA，2012，60：96-111），但其中采用的機械剪切組織制備細胞懸液，仍存在細胞得率低及損傷較大的缺點，雖然Cardona等建立了從鼠腦組織中提取小膠質(zhì)細胞的方法，并且達到了近100%的純度（Nat?Protoc，2006，1:1947–1951），但目前為止，如何高效的從人的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中獲得高純度的小膠質(zhì)細胞仍然存在較大困難。

迄今為止，尚未見有關(guān)結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過免疫磁珠標(biāo)記CD11b有效地從新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞，并在體外培養(yǎng)擴增的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種分離純化小膠質(zhì)細胞的方法，尤其是從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞的方法；該方法結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過免疫磁珠標(biāo)記CD11b有效地從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞，并在體外培養(yǎng)擴增，為小膠質(zhì)細胞與腫瘤免疫逃逸關(guān)系的研究提供重要的基礎(chǔ)。

本發(fā)明中，首先采用機械剪切聯(lián)合酶消化的方法提高細胞得率及減小細胞損傷，具有操作簡便、效果顯著的特點。

本發(fā)明中，結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細胞，其中的Percoll為包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒；其滲透壓低（＜20mosm/kg?H2O)，粘度小，可形成高達1.3g/ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達到滿意的細胞分離效果；由于Percoll擴散常數(shù)低，所形成的梯度較穩(wěn)定；此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，可用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，以及將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離；