[發明專利]一種分離純化小膠質細胞的方法

在審

• 申請號: 201210380987.5
• 申請日: 2012-10-09
• 公開（公告）號: CN103710306A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 毛穎;葉紅星;姚瑜;岳琪;莫鏈杰;張新;周良輔
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種分離純化小膠質細胞的方法，其特征在于，其包括步驟：

步驟一，結合物理分離和酶的消化作用，將離體的新鮮的膠質瘤組織標本制成單細胞懸液；

步驟二，采用不同濃度Percoll溶液分離、富集小膠質細胞，并將其與髓磷脂及紅細胞碎片分開；

步驟三，利用免疫磁珠分選CD11b陽性的細胞，提高小膠質細胞的分離純度。

2.按權利要求1的方法，其特征在于，所述步驟一中：取離體的新鮮的膠質瘤標本2-3g，置于盛有5ml的1640培養液培養皿中，用剪刀將其剪碎，置入15ml離心管，1500rpm，離心5分鐘，棄上清；加入1mg/ml的木瓜蛋白酶4-5ml，37℃消化30分鐘，加血清終止消化，1500rpm，離心5分鐘，棄上清，用10ml的1640培養基重懸，過40μm濾網過濾于15ml離心管，得單細胞懸液，1500rpm離心5分鐘，棄上清；

所述步驟二中：向上述15ml離心管中依次加入70%Percoll溶液4ml，30%Percoll溶液8ml，最后加入HBSS?2ml，500g，加減速度設為低速，離心30分鐘，用巴氏管從70%與30%Percoll溶液的界面吸取細胞，PBS重懸后1500r/分鐘離心5分鐘，棄上清；

所述步驟三中：用80μl的MACS緩沖液重懸上步驟所得細胞，加入包被抗人CD11b抗體的免疫磁珠20μl，4℃放置15分鐘，加入1ml的MACS緩沖液洗滌兩次，離心去除未與細胞結合的磁珠抗體，棄上清，重新用500μl的MACS緩沖液重懸細胞，500μl的MACS緩沖液預洗MS磁性分選柱2次后，將500μl細胞懸液過柱，500μl的MACS緩沖液，去除非標記陰性細胞，移柱出磁場，用1ml的MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，所述離體的新鮮腦膠質瘤組織放置于冰上并20小時內處理；采用機械剪切聯合木瓜酶消化進行處理。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，配置2個不同密度Percoll分離液，底部一層為70%Percoll液4ml，中間一層為30%Percoll液8ml,最上一層為2ml的HBSS。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，配置不同密度Percoll分離液；用70%percoll重懸成單細胞懸液，加入離心管，然后依序加入30%percoll液及HBSS層，30min,4℃,低加減速度離心，取細胞懸液用CD11b流式抗體檢測小膠質細胞的純度。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，吸取離心后的percoll?70%和30%交界處細胞，加入PBS,1200rpm,室溫，離心，去上清。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，取少量細胞進行CD11b流式抗體檢測小膠質細胞的純度，其余細胞繼續磁珠分選純化操作。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟三中，用MACS緩沖液重懸所得細胞，加入包被抗人CD11b抗體的免疫磁珠，4℃放置，加入MACS緩沖液重懸細胞，離心去除未結合的磁珠抗體，棄上清，用MACS緩沖液重懸細胞，500μl/次緩沖液預洗MS磁性分選柱2次后，將500μl細胞懸液過柱，500μl緩沖液洗柱兩次，去除非標記陰性細胞，移柱出磁場，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽性細胞；再檢測小膠質細胞的純度。

9.根據權利要求所述1的方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟：在1640+10%FBS含血清培養基中添加50U/ml的GM-CSF細胞因子，制成小膠質細胞培養基。