[發(fā)明專利]一種高特異高敏感檢測食源性致病性耶爾森氏菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210380459.X
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN103725752A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金京勛;呂少波;李蘇楊
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測食源性致病性耶爾森氏菌的方法。

背景技術(shù)

耶爾森氏菌為動物腸道寄生菌，廣泛存在于動物體內(nèi)。本菌在外界環(huán)境(河水、井水、蒸餾水)中不僅可長期生存，而且可以繁殖。本菌有嗜冷性，食品一旦被污染，在冷藏中仍能繼續(xù)繁殖，故該病冬季多發(fā)。現(xiàn)代文明的“電冰箱腸炎”致病菌，就是人獸共同的耶爾森氏菌。?耶爾森氏菌屬包括11種，其中對人有致病性的有三種：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核菌已確定是食源性病原體。快速檢測食源性致病性耶爾森氏菌對于食品衛(wèi)生具有很大的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是由日本榮研（EIKEN）株式會社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，設(shè)計針對耶爾森氏菌特異性基因序列的一對外引物（Y-F3和Y-B3）和一對內(nèi)引物（Y-FIP和Y-BIP）進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測食源性致病性耶爾森氏菌的方法，提高了食源性致病性耶爾森氏菌的檢測和診斷效率。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種高特異高敏感檢測食源性致病性耶爾森氏菌的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應(yīng)液

反應(yīng)液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶??????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液?????????????????1X，MgSO4?2mM

4M?甜菜堿????????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液????????????????????????????400μM

內(nèi)引物

???Y-FIP???????????????????????????????????40umol

???Y-BIP???????????????????????????????????40umol

外引物

???Y-F3????????????????????????????????????5umol

???Y-B3????????????????????????????????????5umol

標(biāo)本核酸???????????????????????????????????20ng

添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul;

步驟2）將上述反應(yīng)液放入63℃烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽性;

步驟3）提取臨床分離空腸耶爾森氏菌，大腸耶爾森氏菌，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。

進(jìn)一步的，所述外引物Y-F3的序列為TCTCACACACTAAAAACTGC。

進(jìn)一步的，所述外引物Y-B3的序列為ACCATATGGCTGGAACAAG。??

進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物Y-FIP的序列為

TTGATTCGATTCACGGATTGCTTT-AAATAGCTATACCGATGTGACT。

進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物Y-BIP的序列為ATTCCGTCAACTTGACAACCG-TGAACTGGCTAAACCTTTGT。

進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實時檢查。

進(jìn)一步的，所述食源性致病性耶爾森氏菌包括空腸耶爾森氏菌和大腸耶爾森氏菌。

本發(fā)明的有益效果是：

????本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測食源性致病性耶爾森氏菌，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。

?一種高特異高敏感檢測食源性致病性耶爾森氏菌的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應(yīng)液

反應(yīng)液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶??????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液?????????????????1X，MgSO4?2mM