[發明專利]一種二氫乳清酸酶法制備α-天冬氨酰小肽的方法

有效

• 申請號: 201210379592.3
• 申請日: 2012-10-09
• 公開（公告）號: CN102864196A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 武紅麗;曹飛;張煜;薄薇;周佳棟;姚琴
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

技術領域

本發明涉及一種二氫乳清酸酶法制備α-天冬氨酰小肽的方法。

背景技術

α-天冬氨酰小肽類化合物是指天冬氨酸的α-位羧基與其他氨基酸或小肽類化合物形成的小肽類化合物（一般不超過兩個氨基酸），這些小肽類化合物及其衍生物在食品、藥品領域具有重要的應用價值。如各種甜味劑：L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（阿斯巴甜）、L-α-天冬氨酞-N-(2，2，4，4-四甲基-3-硫化三亞甲基)-D-丙氨酰胺（阿力甜）、N-[N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天門冬氨酰]-L-苯丙氨酸甲酯（樂甜）、β-O-芐基-L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（蔗糖甜味的1000倍）、L-α-天冬氨酰-O-冰片基-L-絲氨酸甲醋等等。這些甜味劑其甜味均超過蔗糖甜味200倍以上，而且熱量低、口味純正、安全性高，主要添加于飲料、維他命含片或口香糖代替糖的使用，許多糖尿病患者、減肥人士都以阿斯巴甜做為糖的代用品。但這些甜味劑的結構中均要求N-端氨基酸必須是天冬氨酸或氨基丙二酸。

另外，N-乙酰天冬氨酰谷氨酸（NAAG）是哺乳動物腦組織內一種含量很高，且分布特異的神經二肽，具有重要生理學和藥學價值。相關研究表明：N-乙酰天門冬氨酰谷氨酸可被酸性二肽酶(NAALAD)分解得到N-乙酰天門冬氨酸和L-谷氨酸。其在下丘腦中的含量低于中腦、腦橋和脊髓，主要存在于腦內某些感覺和運動系統中，在興奮性神經傳遞過程中起神經遞質或調質的功能。在治療阿爾茨海默氏癥、帕金森癥、肌萎縮側索硬化癥、亨廷頓氏病、精神分裂癥等疾病上有一定的藥學作用，同時可以有效促進腦功能恢復，在治療視神經炎及視神經萎縮方面也有一定的作用。

目前，α-天冬氨酰小肽類化合物的制備方法主要有化學合成法、酶法和微生物發酵法，其關鍵步驟在于將天冬氨酸的α-羧基與氨基酸形成肽鍵過程。在此過程中，化學合成法易產生天冬氨酸消旋化或β-位羧基參與合成的副反應。例如在阿斯巴甜的化學合成過程中，按天冬氨酸衍生物的種類和合成中關鍵中間體的不同，化學法合成又可以分為9種不同的途徑：內酐法、內酯法、N-羰基酸酐法、羰基硫代酸酐法、活性酯法、混合酸酐法、直接縮合法、樹脂法、L-天冬酰胺法，而較有實用價值，應用的最多的還是內酐法和內酯法。無論采用哪種合成方法，總會產生天冬氨酸消旋化或β-位羧基參與合成的副反應，其副產物是D-Asp的α-羧基或Asp的β-羧基與氨基酸形成的異構體，這些副產物很難除去。因此，對這兩種異構體的處理成為各種合成法中耗時費力的步驟，有效解決這個問題是降低成本的一個關鍵。目前的作法是通過保護β-位羧基而提高α-位羧基的活性，如將β-位羧基保護起來，或者通過酯化活化α-位羧基，或使用不同的反應溶劑等，以使反應產物中α與β-異構體的比值盡可能提高。

酶法合成是使用合適的蛋白酶將L-Asp(氨基已保護或未保護)與氨基酸縮合在一起，或者利用天冬氨酸酶，以富馬酰-氨基酸為底物，加氨或氨供體，形成最終的α-天冬氨酰小肽。例如，1979年Isowa?Y．等用嗜熱菌蛋白酶(Thermolysinthermoase)成功地利用L-苯丙氨酸甲酯和被護L-天冬氨酸合成a-APM前體；樊可可等采用木瓜蛋白酶在乙酸乙酯和水組成的兩相溶劑中催化合成了芐氧羰基-L-天冬氨酸-α-甲酯；采用內酞酶(Endepeptidase)可催化苯甲酰基-L-天冬氨酸-a-甲酯與苯丙氨酸甲酯反應，生成苯甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；而利用嗜熱脂肪芽胞桿菌(Baci?l?lussteaarothermophilus)的中性蛋白酶，在pH值為6.4水溶液中將芐氧羰基-L-天冬氨酸同苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽反應生成芐氧羰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。另外，以順丁烯二酸酐(馬來酐)與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，用化學法縮合得馬來酰-L-苯丙氨酸甲酯(MPM)，并使之異構化為富馬酰-L-苯丙氨酸甲酯(FPM)，然后以FPM為底物，加氨或氨供體，經菌體轉化直接生成阿斯巴甜(APM)。Nakayama等人報道了用多種微生物轉化FPM為APM的研究，其中以大腸桿菌ATCCl1303轉化率最高(4.3g/L)，許激揚等采用自篩的E.coli?CPU8901，使產物質量濃度提高至5.6g/L。樊可可等則篩選到一株假單胞菌，發現它能直接以MPM為底物，經順反異構與加氨兩步連續的酶促反應直接生成APM，而且產物質量濃度提高到6.3g/L。