[發明專利]一種二氫乳清酸酶法制備α-天冬氨酰小肽的方法

有效

• 申請號: 201210379592.3
• 申請日: 2012-10-09
• 公開（公告）號: CN102864196A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 武紅麗;曹飛;張煜;薄薇;周佳棟;姚琴
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

1.一種二氫乳清酸酶法制備α-天冬氨酰小肽(1)的方法，其特征在于該方法包括下列步驟：

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?1）以L-二氫乳清酸為原料，與氨基酸酯或小二肽類酯化合物在接肽試劑作用下進行接肽反應，形成L-二氫乳清酸小肽酯類化合物；

2）采用稀堿溶液處理L-二氫乳清酸小肽酯類化合物，水解酯鍵，暴露出末端羧基；

3）以二氫乳清酸酶或含有二氫乳清酸酶的菌體為催化劑，在弱堿性條件下水解暴露出末端羧基的L-二氫乳清酸小肽類化合物，形成N-氨甲酰化-α-天冬氨酰小肽化合物；

4）采用亞硝酸水解脫去N-氨甲酰化-α-天冬氨酰小肽化合物的氨甲酰基團即可獲得α-天冬氨酰小肽類化合物。

2.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于所述的α-天冬氨酰小肽(1)的R₁基團為甘氨酸、L或D-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、氨基丁酸的殘基；或者是L或D-甘氨酰-、丙氨酰-、纈氨酰-、亮氨酰-、異亮氨酰-、苯丙氨酰-、脯氨酰-、色氨酰-、絲氨酰-、酪氨酰-、半胱氨酰-、蛋氨酰-、天冬酰胺酰-、谷氨酰胺酰-、蘇氨酰-、天冬氨酰-、谷氨酰-、賴氨酰-、精氨酰-、組氨酰-甘氨酸小肽的殘基。

3.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步驟1）中所述的氨基酸酯或小二肽類酯化合物為甘氨酸、L或D-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、氨基丁酸的α-酯；或者是L或D-甘氨酰-、丙氨酰-、纈氨酰-、亮氨酰-、異亮氨酰-、苯丙氨酰-、脯氨酰-、色氨酰-、絲氨酰-、酪氨酰-、半胱氨酰-、蛋氨酰-、天冬酰胺酰-、谷氨酰胺酰-、蘇氨酰-、天冬氨酰-、谷氨酰-、賴氨酰-、精氨酰-、組氨酰-甘氨酸的α-酯中的任意一種。

4.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步驟1）中，所用的接肽試劑為DCC/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSu和DCC/HOAt中的任意一種。

5.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步驟3）中，所述含有二氫乳清酸酶的菌體為大腸桿菌K-12；所述的二氫乳清酸酶為含有二氫乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his質粒的重組菌株E.coli?Rosetta(DE3)所表達、純化的二氫乳清酸酶。

6.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步3）中，所述的弱堿性條件為pH7.5~9.5。

7.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步驟3）中，所述的酶或濕菌體與帶有末端羧基的二氫乳清酸小肽類化合物的重量比為1:1~80。

8.根據權利要求1所述的二氫乳清酸酶法制備天冬氨酰小肽方法，其特征在于步驟4）中，所述的亞硝酸為亞硝酸鈉與稀鹽酸的混合溶液；或者在稀鹽酸-底物溶液中滴加亞硝酸鈉溶液。