[發明專利]用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗的重組蛋白HF2及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210379588.7
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN102977214A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 馮強;鄒全明;曾浩;樊紹文;盧陸;董衍東;魯東水;吳翼;蔡昌芝
• 申請（專利權）人: 重慶原倫生物科技有限公司;中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/085;A61P31/04;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與纖連蛋白結合蛋白A活性片段的重組蛋白HF2，本發明進一步涉及該重組蛋白的制備方法及其在制備疫苗和檢測試劑盒中的應用。?

背景技術

金黃色葡萄球菌能導致人體產生廣泛的疾病，如菌血癥，心內膜炎，毛囊炎，疔，癤，癰，膿皰病，蜂窩(組)織炎，葡萄狀菌病，毒性休克綜合癥，中樞系統感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及關節感染，呼吸系統感染等，給人類健康帶來極大的威脅。而由于該菌的多重抗生素耐藥性使得局面更加難以控制，治療手段的選擇越來越少。?

免疫學手段被寄以厚望用以控制金黃色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黃色葡萄球的感染及傳播。免疫策略可以分為主動免疫與被動免疫，被動免疫用靶向金黃色葡萄球菌的抗體進行，主動免疫通過選擇合適的抗原促使機體產生免疫反應。合適的多糖及多肽都可以作為抗原構成疫苗的有效組分。如多糖CP5，CP8被Nabi公司用作疫苗組分；蛋白IsdB被Merck公司用作疫苗組分。?

Hla是一個在大多數臨床分離株上都表達的穿孔形成毒素。它與多種疾病有關如肺炎，敗血癥關節炎及腦膿瘡等。Hla單體約33kDa，以七聚體形式發揮功能，每個單體的第110-150氨基酸互相靠攏在磷脂雙分子層上形成孔。隨后導致細胞膜破壞，胞內離子滲出等。其毒性很強，在很低濃度情況下即可致病。因此，誘導機體產生高效抗Hla抗體應是控制金黃色葡萄球菌感染的一個重要方面。我們在此發明中將突變后無毒的Hla（H35L）作為疫苗的候選組分之一。?

纖維連接蛋白結合蛋白（FNBA）是一表面相關多功能受體，特異可逆結合?于人纖維連接蛋白，fibrin,fibrinogen等。該結合在機體手術及受傷情況下使細菌有效粘附，隨之侵入定植。FNBP為一929個氨基酸約106kDa的酸性蛋白。誘導機體產生其抗體可以阻止SA粘附于人組織，進而阻止感染。由于FNBA分子量大，難于用重組工程菌進行完整蛋白的表達，我們將FNBA成熟肽第464-904氨基酸作為候選疫苗之一。?

發明內容

針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性，本發明提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌alpha溶血素無毒突變體與纖連蛋白結合蛋白A活性片段的重組融合重組蛋白，其可應用于制備抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。本發明采用基因工程技術重組表達所述融合蛋白，不僅表達量高便于分離純化而且高效安全。動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。?

重組融合蛋白由金黃色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）與纖維連接蛋白結合蛋白(FNBA)片段組成，其中，Hla與FNBA通過連接肽融合。所述重組融合蛋白具有Hla-Linker-FNBA的結構特點，簡稱HF2；具有SEQ?ID?NO:1的DNA序列及SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。?

所述連接肽為Linker，該連接肽為-(Linker)n-，其中Linker為GGGGS或GGSGG或YAPVDV，n為1-4，優選Linker為GGGGS，n為1。?

所述Hla為第110-150缺失的突變體Hla(delta?110-150)及Hla(H35L,delta110-150)的金黃色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla。?

所述Hla優選第110-150缺失的突變體Hla(H35L,delta110-150)的金黃色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。?

所述FNBA為金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白膜外區，具體地指金黃色葡萄球菌纖維連接蛋白結合蛋白膜外區，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:6所示。?

上述的重組融合蛋白的制備方法蛋白，包括以下步驟：?

1）全基因合成以獲得編碼Hla(H35L?delta110-150)的DNA序列；?

2）用核酸序列如SEQ?ID?NO:7及SEQ?ID?NO:8所示的正向和反向引物，擴增出重組融合蛋白的Hla部分；?

3）用核酸序列如DNA序列為SEQ?ID?NO:9及SEQ?ID?NO:10所示的正向和反向引物，從MRSA基因組擴增出重組融合蛋白的FNBA部分；?

4）以Hla及FNBA做模板，用核酸序列如SEQ?ID?NO:7及SEQ?ID?NO:10所示的正向和反向引物擴增出重組融合蛋白HF2片段；?