[發明專利]從RNA樣本富集轉錄本的方法及其用途

有效

• 申請號: 201210379402.8
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN103710336B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 祝珍珍;黃文潘;章文蔚;陳茂山;張艷艷
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技服務有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/68;C40B60/14;C12M1/34
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的，本發明涉及從RNA樣本富集轉錄本的方法及其用途，更具體的，本發明涉及從RNA樣本富集轉錄本的方法、構建測序文庫的方法、測序文庫、核酸樣本測序方法、確定轉錄起點(transcription?start?site,TSS)的方法、用于從RNA樣本富集轉錄本的富集試劑、構建測序文庫的裝置、核酸樣本測序設備以及確定TSS的系統。?

背景技術

基因的轉錄過程是從RNA聚合酶與DNA模板的啟動子位置結合開始，然后從轉錄起點(transcription?start?site,在本文中簡稱為：TSS)進行轉錄延伸，最終形成完整的RNA。生物體內存在的RNA分子都是從TSS開始的，因此通過高通量測序研究TSS有助于我們從全基因組推測啟動子的位置及結構，從而全局了解基因轉錄調控網絡。TSS的研究也有助于修正原有的基因注釋或發現新的基因。?

然而，目前對于TSS的研究，仍有待改進。?

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠有效富集轉錄本，?進而可以有效確定TSS的手段。?

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：?

目前，關于高通量測序研究TSS的方法通常是針對具有帽子結構的RNA，采用CAGE或RACE的方法捕獲RNA分子的5’末端。常見的有deepCAGE，PEAT，deep-RACE，nanoCAGE和CAGEscan。其中deepCAGE，PEAT，deep-RACE和CAGEscan需要酶切等繁瑣操作，對RNA的要求量很高，而且產生的測序序列（reads）較短（大約20nt），只適用于具有帽子結構的RNA，不能用于沒有帽子結構的原核RNA的TSS的研究。盡管nanoCAGE操作比較簡單，對RNA的使用量要求也低，但是也只適用于具有帽子結構的RNA，而且產生的數據中假陽性比較多。發明人發現通過采用5’單磷酸外切酶，能夠特異性地降解5’單磷酸的RNA，保留具有5’帽子和5’三磷酸的完整的RNA分子，可以有效地應用于富集轉錄本，因而能夠同時應用于真核和原核的RNA的TSS的高通量測序，具有操作簡單，準確率高和成本低的眾多優點。?

在本發明的第一方面，本發明提出了一種從RNA樣本富集轉錄本的方法。根據本發明的實施例，該從RNA樣本富集轉錄本的方法包括：利用富集試劑對RNA樣本進行處理，以便富集轉錄本，其中，所述富集試劑具有5’-單磷酸外切酶活性，所述轉錄本為在其5’末端具有帽子結構或5’三磷酸的RNA分子。由于5’單磷酸外切酶，能夠特異性地降解5’單磷酸的RNA，而不會降解具有5’帽子和5’三磷酸的完整的RNA分子，從而利用具有該5’單磷酸外切酶活性的富集試劑，可以有效地富集轉錄本，因而能夠同時應用于真核和原核的RNA的TSS的高通量測序，具有操作簡單，準確率高和成本低的眾多優點。?

在本發明的第二方面，本發明提出了一種構建測序文庫的方法。根據本發明的實施例，該構建測序文庫的方法包括：根據前面所述的方法，從RNA樣?本富集轉錄本；去除所述轉錄本的5’帽子結構或5’三磷酸，以便獲得去除5’帽子結構或5’三磷酸的轉錄本；在去除5’帽子結構或5’三磷酸的轉錄本的5’末端連接RNA接頭，以便獲得連接有RNA接頭的轉錄本；對連接有RNA接頭的轉錄本進行反轉錄，以便獲得與所述轉錄本對應的cDNA；對所述cDNA進行擴增，以便獲得擴增產物；以及基于所述擴增產物，構建測序文庫。由此，利用該方法，能夠有效地針對核酸樣本中所富集的轉錄本構建測序文庫，因而能夠同時應用于真核和原核的RNA的TSS的高通量測序，具有操作簡單，準確率高和成本低的眾多優點。?

在本發明的第三方面，本發明提出了一種測序文庫，其特征在于，是由前面所述的方法構建的。利用該測序文庫，能夠有效的對RNA轉錄本進行測序，能夠同時應用于真核和原核的RNA的TSS的高通量測序，具有操作簡單，準確率高和成本低的眾多優點。?

在本發明的第四方面，本發明提出了一種核酸樣本測序方法。根據本發明的實施例，該核酸樣本測序方法包括：根據前面所述的方法，構建測序文庫；以及對所述測序文庫進行測序，以便獲得測序結果。利用該方法，能夠有效的對RNA轉錄本進行測序，能夠同時應用于真核和原核的RNA的TSS的高通量測序，具有操作簡單，準確率高和成本低的眾多優點。?