[發(fā)明專利]從RNA樣本富集轉錄本的方法及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210379402.8
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN103710336B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發(fā)明（設計）人: 祝珍珍;黃文潘;章文蔚;陳茂山;張艷艷
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技服務有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/68;C40B60/14;C12M1/34
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

1.一種從RNA樣本富集轉錄本的方法，其特征在于，包括：

利用富集試劑對RNA樣本進行處理，以便富集轉錄本，

其中，

所述富集試劑具有5’-單磷酸外切酶活性，

所述轉錄本為在其5’末端具有帽子結構或三磷酸基團的RNA分子。

2.一種構建測序文庫的方法，其特征在于，包括：

根據(jù)權利要求1所述的方法，從RNA樣本富集轉錄本；

去除所述轉錄本的帽子結構或三磷酸基團，以便獲得去除帽子結構或三磷酸基團的轉錄本；

在去除帽子結構或三磷酸基團的轉錄本的5’末端連接RNA接頭，以便獲得連接有RNA接頭的轉錄本；

對連接有RNA接頭的轉錄本進行反轉錄，以便獲得與所述轉錄本對應的cDNA；

對所述cDNA進行擴增，以便獲得擴增產(chǎn)物；以及

基于所述擴增產(chǎn)物，構建測序文庫，

任選地，利用末端修整試劑去除所述轉錄本的帽子結構或三磷酸基團，其中，所述末端修整試劑具有煙草酸焦磷酸酶活性，

任選地，所述反轉錄的反轉錄引物在其末端具有與所述RNA接頭相對應的序列，

任選地，所述反轉錄采用具有SEQ?ID?NO：1所示序列的寡核苷酸作為反轉錄引物，

任選地，所述反轉錄引物中至少一個N被硫代修飾，

任選地，所述反轉錄引物中倒數(shù)第二個N被硫代修飾。

3.一種測序文庫，其特征在于，是由權利要求2~4任一項所述的方法構建的。

4.一種核酸樣本測序方法，其特征在于，包括：

根據(jù)權利要求2所述的方法，構建測序文庫；以及

對所述測序文庫進行測序，以便獲得測序結果，

任選地，所述測序利用Illumina?Hiseq2000、Genome?Analyzer、SOLiD測序系統(tǒng)、Ion?Torrent、Ion?Proton、454、PacBio?RS測序系統(tǒng)、HelicostSMS技術以及納米孔測序技術的至少一種進行的。

5.一種確定轉錄起點的方法，其特征在于，包括：

從宿主提取RNA樣本；

利用權利要求4所述的方法，獲得由多個測序序列構成的測序結果；以及

基于所述測序結果，確定轉錄起點，

任選地，所述RNA樣本為宿主的總RNA的至少一部分，

任選地，基于所述測序結果，確定轉錄起點，進一步包括：

將所述測序數(shù)據(jù)與參考序列進行比對；

基于比對結果，確定所述轉錄起點，

其中，所述參考序列中包含預定基因的5’-UTR序列的至少一部分，選擇能夠和所述參考序列對上、且在所述參考序列最上游的測序序列作為陽性序列，并且確定所述陽性序列的第一位堿基作為所述轉錄起始位點，

任選地，針對原核宿主，所述參考序列包含所述預定基因的翻譯起始位點與該翻譯起始位點上游700bp位點之間的核酸序列，針對真核宿主，所述參考序列包含所述預定基因的翻譯起始位點與該翻譯起始位點上游5000bp位點之間的核酸序列，

任選地，采用SOAP?Alignment進行所述比對，

任選地，進一步包括對所述陽性序列進行篩選，其中所述篩選的原則是：

所述陽性序列的數(shù)目是比對到所述預定基因內(nèi)部的測序序列數(shù)目平均值的N倍以上，其中所述N為大于1的實數(shù)，優(yōu)選地，所述N為至少10的實數(shù)。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，進一步包括對篩選結果進行卡方檢驗，

任選地，所述卡方檢驗的檢驗值為3.84以上。

7.一種用于從RNA樣本富集轉錄本的富集試劑，其特征在于，富集試劑具有5’-單磷酸外切酶活性。