[發明專利]一種基于串聯多內對照的檢測拷貝數變異的方法

有效

• 申請號: 201210378856.3
• 申請日: 2012-10-08
• 公開（公告）號: CN102943109A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 陸炯;陳軼群;肖君華
• 申請（專利權）人: 上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及基于熒光通用引物的和單質粒串聯多內對照的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，應用于生物科學研究與臨床分子診斷。

背景技術

拷貝數變異（copy?number?variations,CNVs）是近年來發現的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中1kb~3Mb的DNA片段的結構變異現象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發生相關，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準確和低成本的CNVs分型檢測技術。

隨著生物技術的發展，不同的研究小組相繼開發了許多的檢測方法，主要包括以雜交為基礎和以PCR為基礎的檢測技術。前者可以在全基因組水平上對CNVs進行檢測，代表技術有微陣列比較基因雜交（SolinasToldo,Lampel?et?al?Genes?Chromosomes?Cancer.1997Dec;20(4):399-407）、全基因組SNP芯片(Irving,Bloodworth?et?al.Cancer?Res.2005?Apr15;65(8):3053-8)、代表性寡核苷酸微陣列技術（Lucito,Healy?et?al.Genome?Res.2003Oct;13(10):2291-305.Epub?2003?Sep?15.）等，其優點是通量高且易于實現自動化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點。后者主要是針對具體的目標位點進行檢測，代表性的技術有實時熒光定量PCR、多重連接探針擴增技術(MLPA)（Schouten,McElgunn?et?al.NucleicAcids?Res.2002?Jun?15;30(12):e57）和多重可擴增探針雜交(MAPH)（Armour,Sismani?et?al.Nucleic?Acids?Res.2000?Jan?15;28(2):605-9.）等。實時熒光定量技術有操作簡單、重復性好、實驗周期短等優點，但是檢測通量較小；與實時熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環境的變化會導致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應也會影響檢測結果。以PCR為基礎的檢測技術存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結果的偏差。

競爭性PCR克服了這個缺陷，實現CNVs的快速、準確、經濟的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產物的量可以用公式Y=A（1+R）ⁿ來表示，其Y表示PCR產物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，n表示PCR的循環數，當PCR擴增效率相同時，PCR產物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一PCR反應體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內對照，兩組模板僅在目標序列長度上（存在一些堿基的插入或缺失）存在一些差異，其他反應條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產物量的比直觀的反映了初始模板（待測樣本和內對照不存在拷貝數差異）量的比，可以根據內對照的初始模板的量來計算樣本的濃度。在檢測拷貝數變異時，當兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時，PCR產物量的比值就反映模板拷貝數的差異。PRT法（Paralogue?Ratio?Test）（Armour,Palla?et?al.Nucleic?Acids?Res.2007;35(3):e19.Epub?2006?Dec14）是基于競爭性PCR的一種檢測CVNs的一種方法，此方法的優點是待測位點和內對照共存于基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進行檢測，而且針對不同檢測位點都要設計一對熒光引物，加大了實驗成本。內對照可以采用人工合成的方法，還有其他的一些制備方法（Zentilin?and?Giacca?Nat?Protoc.2007;2(9):2092-104.）。但如果需要同時進行十多個位點的檢測時，制備多個內對照會花費很多的時間，同時后續多個內對照的定量及其相互間的混合也是非常的繁瑣和復雜。所以本實驗提供一個方案，可非常方便制備多個內對照且省去了后續內對照混合的過程，也大大緩解了后續實驗中內對照污染的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是填補現有技術的空白，提供一種成本低、通量較高、樣本需求低、檢測靈敏性高、僅制備一種質粒即能完成制備所有位點內對照操作簡單的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法。