[發(fā)明專利]一種基于串聯多內對照的檢測拷貝數變異的方法

有效

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• 申請日: 2012-10-08
• 公開（公告）號: CN102943109A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設計）人: 陸炯;陳軼群;肖君華
• 申請（專利權）人: 上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟：?

（1）提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區(qū)段和一對?

位于參照區(qū)段的上下游嵌合特異引物組成：?

所述通用熒光引物長度范圍為10~25bp，5’端用熒光標記，TM值≤57℃值，且通用引物對待測基因組具有特異性；?

所述嵌合特異引物針對待測區(qū)段和參照區(qū)段設計，TM值≥62℃，長度范圍為28~50bp，3’端為18~25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過3℃；

（2）所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；?

（3）提供一種全長內對照DNA，其序列特征在于：所述的全長內對照含有待測區(qū)段和參照區(qū)段的引物間所有序列，每條全長內對照序列含串聯的至少1個拷貝的待測區(qū)段和至少1個拷貝的參照區(qū)段，除了在每個內對照區(qū)段序列的非引物區(qū)增加或減少1-5個任意堿基使得所述的內對照序列比待測區(qū)段和參照區(qū)段長或短1-5個堿基外，每個內對照序列與待測區(qū)段和參照區(qū)段分別完全一致；相鄰的內對照區(qū)段間和所述全長內對照的兩側均有限制性內切酶的酶切位點，且所述的酶切位點不存在于任何一個內對照序列中；使用時，將定量后的全長內對照DNA用限制性內切酶充分消化后，獲得獨立的內對照片段，定量稀釋后獲得內對照稀釋液；?

（4）多重競爭性PCR反應：?

(a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍摩爾數的內對照稀釋液混合在一起，然后進行PCR，在前3~16個循環(huán)中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異引物引導的擴增，在后17~20個循環(huán)中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用熒光引物引導的擴增，且兩組退火溫度的差距≥5℃；?

(b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息；?

（5）數據分析?

i.計算每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積（S）和內對照的峰高和/或峰面積（I），得到每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值（S/I）；?

ii.以一個參照區(qū)段的比值為標準，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進行數據內部標化；?

iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；?

iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。?

2.根據權利要求1所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18~20bp。?

3.根據權利要求1所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38~45bp，且所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異序列段長度范圍分別為18~20bp。?

4.根據權利要求1所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為120~350bp，且所述的可檢出的長度差異為8~50bp。?

5.根據權利要求1所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物含一對通用熒光引物、或者兩對、三對或四對不同熒光標記的通用熒光引物。?

6.根據權利要求5所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一對到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三對到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。?

7.根據權利要求6所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到二十對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。?

8.根據權利要求7所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到十五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。?