[發(fā)明專利]一種小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210375200.6
• 申請(qǐng)日: 2012-10-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103416301A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚明鏡;郭惠芳;楊橋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00;C12N15/82
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，本發(fā)明以小麥成熟胚為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)得到分生組織團(tuán)，并利用獲得的分生組織團(tuán)作受體進(jìn)行基因槍遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。

背景技術(shù)

小麥隸屬于禾本科小麥屬，是世界上最重要的糧食作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展及糧食安全等方面占據(jù)主要地位。隨著世界人口的不斷膨脹，對(duì)糧食的需求量也在不斷增加，糧食的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)成為全世界育種家的共同目標(biāo)。

相對(duì)于傳統(tǒng)育種技術(shù)，新的育種技術(shù)不斷涌現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)基因技術(shù)正在育種界中發(fā)揮主要作用。與重要糧食作物水稻、玉米相比，小麥因其基因組大、重復(fù)序列多、調(diào)控體系異常復(fù)雜等因素，遺傳轉(zhuǎn)化工作相對(duì)滯后。1992年，Vasil等人以長(zhǎng)期培養(yǎng)的胚性愈傷組織為外植體，通過(guò)基因槍轟擊將編碼β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的gus基因及抗除草劑基因bar導(dǎo)入小麥品種“Pavon”，獲得了世界上第一例轉(zhuǎn)基因小麥植株。之后通過(guò)各國(guó)學(xué)者的不斷努力，利用基因槍技術(shù)獲得了不同品系的轉(zhuǎn)基因小麥植株，基因槍技術(shù)也得到不斷完善，但依然存在費(fèi)用高、易出現(xiàn)嵌合體、外源片段一般為多拷貝整合、轉(zhuǎn)基因后代易出現(xiàn)基因沉默等問(wèn)題。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是雙子葉植物常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，因其成本低、操作簡(jiǎn)單、外源基因一般為單拷貝整合等優(yōu)點(diǎn)引起育種家的強(qiáng)烈關(guān)注，但由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，難以利用此方法進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化。直到1997年，Cheng等建立了一個(gè)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥快速轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在小麥中得到應(yīng)用，但轉(zhuǎn)化頻率低，一直以來(lái)未有較大突破。花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家周光宇在1978年提出，但因重復(fù)性和穩(wěn)定性差、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率低、后期檢測(cè)比較困難等問(wèn)題，未在世界范圍得到廣泛應(yīng)用。

目前，小麥遺傳轉(zhuǎn)化的效率主要受制于基因型和受體來(lái)源，克服基因型依賴性、培育合適的受體和建立高效的再生體系是轉(zhuǎn)化頻率提高的保證。現(xiàn)今在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中用到的受體多以幼胚或其愈傷組織為主，轉(zhuǎn)化頻率較高的基因型多為模式小麥（例如Bobwhite）。基因槍轉(zhuǎn)化頻率分別為0.1%～16.7%（Jiarui?Li,et?al.,2012）。除了幼胚以外，也有以小麥幼穗、花藥、花序等作為受體，但這些材料的取材均受季節(jié)限制，給轉(zhuǎn)化工作帶來(lái)不便，成熟胚取材不受季節(jié)限制、取材方便，以其誘導(dǎo)的愈傷或胚性愈傷組織在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用并獲得轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化頻率更低。近年來(lái)，利用小麥幼胚愈傷誘導(dǎo)叢生芽及莖尖誘導(dǎo)叢生芽（Sanjay?Singh?Parmar，et?al.,2012）引起關(guān)注，但起步較晚，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，轉(zhuǎn)化工作進(jìn)展緩慢。

本發(fā)明利用小麥成熟胚誘導(dǎo)形成的分生組織團(tuán)，誘導(dǎo)周期短，分生組織團(tuán)表面光滑致密，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均一，具有很強(qiáng)的再生能力，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的再生植株，可在一定程度上提高遺傳轉(zhuǎn)化的頻率，是一種值得關(guān)注的新型受體。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有關(guān)分生組織團(tuán)培養(yǎng)及其在遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用等方面的報(bào)道，也未見(jiàn)相關(guān)的專利技術(shù)公開(kāi)或使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服小麥現(xiàn)有再生體系再生率低及遺傳轉(zhuǎn)化受體范圍有限，且受體材料取材受季節(jié)限制、轉(zhuǎn)化頻率低等的缺陷，以小麥成熟胚經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)快速得到分生組織團(tuán),進(jìn)行再生和遺傳轉(zhuǎn)化，以建立小麥高頻再生體系及提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化頻率。

本發(fā)明提供了一種小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體即分生組織團(tuán)的培養(yǎng)方法，此方法簡(jiǎn)單易行，培養(yǎng)周期短、效率高。

本發(fā)明提供了一種小麥成熟胚誘導(dǎo)的分生組織團(tuán)在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，此受體再生能力強(qiáng)，可快速獲得大量轉(zhuǎn)化再生植株，提高遺傳轉(zhuǎn)化頻率，縮短育種周期，加快小麥遺傳改良進(jìn)程。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

一種利用小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體即分生組織團(tuán)培養(yǎng)快速獲得再生植株的方法，其過(guò)程包含下列步驟：

（1）選取健康、飽滿的成熟冬小麥或春小麥種子放入三角瓶中，用75%酒精處理3-5分鐘，無(wú)菌水沖洗1-3次，0.1%升汞溶液處理7-15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3-5次，在三角瓶中加入無(wú)菌水，于25℃條件下浸泡14-18h，備用；