[發明專利]一種小麥遺傳轉化受體的培養方法及應用

有效

• 申請號: 201210375200.6
• 申請日: 2012-10-07
• 公開（公告）號: CN103416301A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 姚明鏡;郭惠芳;楊橋
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/82
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種利用小麥遺傳轉化受體即分生組織團培養快速獲得再生植株的方法，其特征包含下列步驟：

（1）將冬小麥或春小麥的種子滅菌：選取健康、飽滿的成熟冬小麥或春小麥種子放入三角瓶中，用75%酒精處理3-5分鐘，無菌水沖洗1-3次，0.1%升汞溶液處理7-15分鐘，最后用無菌水沖洗3-5次，在三角瓶中加入無菌水，于25℃條件下浸泡14-18h，備用；

（2）在超凈工作臺中，用滅過菌的手術刀或解剖針取出冬小麥或春小麥種子成熟胚，接入誘導培養基上培養，一周后保留幼苗基部生長部位，切去伸展的葉片組織和根組織，每15d繼代一次；繼代時保留膨大基部并切去伸展的葉片組織，培養至30天以后獲得外露或被殘留葉片包被、表面光滑、呈綠色或淺綠色的細胞組織致密的分生組織團，其直徑>5mm，培養至40d~50d為分生組織團產生高峰；前述培養過程中的前15d進行暗培養，之后進行光培養，即每天光照16h，光照強度為2000lux，培養溫度為25±2℃；

（3）將步驟（2）所得的分生組織團接入分化培養基上培養，至產生叢生芽；

（4）將步驟（3）所得的叢生芽分離后接入生根培養基上培養至獲得生根苗；

（5）依據小麥的類型，將步驟（4）所得的冬小麥生根苗進行春化處理，即在4℃下處理15-25d，對所獲得的春小麥生根苗不進行春化處理；將上述生根苗煉苗后移栽；

上述步驟中涉及的培養基組分及配比如下所示：

誘導培養基：MS基本培養基+15g/L葡萄糖+15g/L麥芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L?2,4-D，瓊脂6.5g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至5.8；

分化培養基：MS基本培養基+15g/L葡萄糖+15g/L麥芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲，瓊脂6.5g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至5.8；

生根培養基：1/2MS基本培養基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸，瓊脂4～6g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至5.8。

2.如權利要求1所述的方法在小麥遺傳轉化中的應用，其特征包含如下步驟：

（1）將冬小麥或春小麥的種子滅菌：選取健康、飽滿的成熟冬小麥或春小麥種子放入三角瓶中，用75%酒精處理3-5分鐘，無菌水沖洗1-3次，0.1%升汞溶液處理7-15分鐘，最后用無菌水沖洗3-5次，在三角瓶中加入無菌水，于25℃條件下浸泡14-18h，備用；

（2）在超凈工作臺中，用滅過菌的手術刀或解剖針取出冬小麥或春小麥種子成熟胚，接入誘導培養基上培養，一周后保留幼苗基部生長部位，切去伸展的葉片組織和根組織，每15d繼代一次；繼代時保留膨大基部并切去伸展的葉片組織，培養至30天以后獲得外露或被殘留葉片包被、表面光滑、呈綠色或淺綠色的細胞組織致密的分生組織團，其直徑>5mm，培養至40d~50d為分生組織團產生高峰；前述培養過程中的前15d進行暗培養，之后進行光培養，即每天光照16h，光照強度為2000lux，培養溫度為25±2℃；

（3）選取冬小麥或春小麥分生組織團進行遺傳轉化，即：基因槍轟擊前4-6h將小麥分生組織團接入高滲培養基，在1100psi/6cm或1350psi/9cm條件下轟擊，轟擊后繼續在高滲培養基上處理16～18h；

（4）將步驟（3）轉化后的材料接入篩選培養基中，培養30-60d，得到再生抗性幼芽；

（5）將步驟（4）得到的抗性幼芽少量進行GUS染色，鑒定轉基因是否成功，將大量抗性幼芽接入生根篩選培養基中，直至得到生根苗；

（6）將步驟（5）得到的生根苗中的冬小麥進行春化處理，即在4℃下處理15-25d，對春小麥無需進行春化處理；將上述生根苗煉苗后移栽，得到抗性植株；

（7）對步驟（6）獲得的抗性植株進行GUS染色或進行PCR擴增或除草劑抗性檢測以鑒定是否為轉基因植株；

（8）采用touchdown?PCR方法進行擴增，擴增用的引物對的DNA序列如下所示：

上游引物：5'-CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'，

下游引物：5'-CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3'；

反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重復2個循環；后隨退火溫度遞減2度重復3個循壞即：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重復2個循環……至退火溫度為44℃，重復16個循環；72℃繼續延伸5min；10℃保溫1h。

（9）用含有200mg/L草丁膦的水溶液涂抹抗性植株葉片的兩面，將6d后轉基因植株保持綠色或僅葉尖部位呈黃色的植株選留，將葉片尖端至葉中明顯變黃的非轉基因植株剔除；

上述培養中的培養基組分及配比如下所示：

誘導培養基：MS基本培養基+15g/L葡萄糖+15g/L麥芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L?2,4-D，瓊脂6.5g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至5.8；

高滲培養基：MS基本培養基+15g/L葡萄糖+15g/L麥芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L?2,4-D+0.4mol/L甘露醇，瓊脂6.5g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至5.8；

篩選培養基：MS基本培養基+15g/L葡萄糖+15g/L麥芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲+5mg/L草丁膦，瓊脂6.5g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調培養基的pH至；5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高壓蒸汽滅菌15分鐘；其中草丁膦在滅菌后加入，添加方法為，在超凈工作臺上向冷卻后的培養基中加入草丁膦混勻備用；

生根篩選培養基：1/2MS基本培養基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸+2mg/L草丁膦，瓊脂4～6g/L；用蒸餾水將上述培養基定容至1L；滅菌前調該培養基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高壓蒸汽滅菌15分鐘；其中草丁膦在滅菌后加入，添加方法為，在超凈工作臺上向冷卻后的培養基中加入草丁膦混勻備用。