[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210372540.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102925532A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張效偉;蘇冠勇;夏潔;于紅霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/02
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 蔣海軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于快速確定物質(zhì)毒性和其致毒機(jī)理的新方法，更具體的說(shuō)是一種用于純化合物或復(fù)雜環(huán)境介質(zhì)樣品的毒性預(yù)測(cè)致毒機(jī)理的高通量篩選方法。?

背景技術(shù)

關(guān)于從分子水平研究化合物致毒機(jī)理的研究，目前已經(jīng)被大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的致毒機(jī)理有：一氧化碳與血紅蛋白的緊密結(jié)合，使其失去輸氧能力而致毒；汞等重金屬毒物會(huì)與酶活性中心的巰基結(jié)合，抑制酶的活性而致毒。還有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，一些環(huán)境有毒污染物的致癌、致畸和致突變作用與它們能改變或損傷機(jī)體的DNA的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)功能有密切關(guān)系。例如亞硝胺改變DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄功能，會(huì)造成染色體的突變而致癌；多環(huán)芳烴、芳香胺和芳香族偶氮化合物由于會(huì)引起DNA損傷，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖失控，從而形成腫瘤。然而，從宏觀上全方位的評(píng)價(jià)一個(gè)化合物或環(huán)境毒物的致毒機(jī)理，僅僅掌握這些信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。?

大腸埃希氏菌，又稱(chēng)大腸桿菌，作為一種通常用來(lái)揭示某種具有某種普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象的模式生物，有研究者繪制其體內(nèi)的染色體藍(lán)圖，并對(duì)其體內(nèi)大部分基因的功能進(jìn)行了推斷和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這就為基于毒理生物個(gè)體從宏觀上對(duì)環(huán)境毒物的致毒機(jī)理進(jìn)行判斷提供了一種可能。隨后，在Nature?Method有文章刊出，Alon?Zaslaver等人進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌體內(nèi)2000多個(gè)不同的、涵蓋大部分基因的啟動(dòng)子進(jìn)行標(biāo)記，每一個(gè)啟動(dòng)子均由低拷貝質(zhì)粒表達(dá)而來(lái)，這就使得大腸桿菌體內(nèi)高精度基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲得提供一個(gè)便利的手段。目前，采用該技術(shù)相關(guān)研究報(bào)道，大多數(shù)僅限于某種或者某一類(lèi)具有特定功能的基因。?

通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)沒(méi)有關(guān)于采用全基因組對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行毒性的確定和致毒機(jī)理評(píng)價(jià)的報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

1．發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有的對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行毒性的確定方法的完整性和準(zhǔn)確度的缺乏，本發(fā)明提供一種基于大腸桿菌全基因組活細(xì)胞芯片技術(shù)的評(píng)價(jià)方法，通過(guò)本發(fā)明可以對(duì)環(huán)境毒物的細(xì)胞毒性和致毒機(jī)理進(jìn)行高通量測(cè)試全基因組測(cè)試。?

2．技術(shù)方案：?

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于高通量篩選技術(shù)和大腸桿菌全基因組的環(huán)境毒物致毒機(jī)理評(píng)價(jià)方法，其包括以下步驟：

(1)??????首先，測(cè)試環(huán)境毒物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用，在96孔板內(nèi)接種相同密度的大腸桿菌，當(dāng)細(xì)菌吸光度OD600值達(dá)到0.1時(shí)，根據(jù)細(xì)菌對(duì)環(huán)境毒物的耐受性，加入具有一定劑量的環(huán)境毒物，并繪制S型曲線，求算環(huán)境毒物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的EC20；

(2)??????取出凍存于-80攝氏度的存有大腸桿菌的96孔板母板（共21塊，大腸桿菌基因庫(kù)購(gòu)自Thermo?Scientific公司），在室溫下放置至其融化，迅速用復(fù)制觸角將其轉(zhuǎn)移復(fù)制入一塊裝有新鮮培養(yǎng)基的96孔板新板，培養(yǎng)細(xì)菌約3個(gè)小時(shí)，將其分裝入384孔板，此時(shí)，板孔內(nèi)吸光度OD600應(yīng)該在0.1左右；

(3)??????選擇0、0.01*EC20、0.1*EC20和EC20作為4個(gè)測(cè)試濃度，在384孔板內(nèi)快速加入受試環(huán)境毒物；

(4)??????將加過(guò)受試化合物的384孔板放入酶標(biāo)儀，記錄其熒光讀數(shù)在4個(gè)小時(shí)內(nèi)的變化情況。

本發(fā)明步驟（1）中的96孔板，由Corning（NY，USA）公司提供，貨號(hào)：CLS3599。?

步驟（2）中的384孔板由NUNC（NY,?USA）公司提供，貨號(hào)：142761。?

步驟（3）中酶標(biāo)儀由BioTek（Winooski，VT）公司提供。?

有益效果：?

本發(fā)明基于高通量篩選技術(shù)，采用熒光標(biāo)記的大腸桿菌作為模式生物，提供了一種涵蓋大腸桿菌體內(nèi)大部分基因的環(huán)境毒物致毒機(jī)理評(píng)價(jià)方法。它一方面具有基因芯片技術(shù)的研究效果，為研究者提供高品質(zhì)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)；同時(shí)該技術(shù)更快捷、簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程；并且，該技術(shù)具有很高的可重復(fù)性；成本低，可以最大程度的避免人為操作誤差或干擾。

同時(shí)，該技術(shù)在污染毒物篩選中，不僅可以考慮到化合物的可利用性，同時(shí)可以兼顧多化合物的復(fù)合毒性，以便可以對(duì)生物樣品的潛在毒性有一個(gè)更加全面的分析；它采用更敏感的基因表達(dá)變化作為指標(biāo)，它結(jié)束了許久以來(lái)僅僅依靠細(xì)菌生長(zhǎng)抑制、生存這些簡(jiǎn)單生理指標(biāo)來(lái)判斷化合物毒性的現(xiàn)狀；它所標(biāo)記的每一個(gè)菌種所標(biāo)記的基因均代表一種致毒通道，這對(duì)于判斷化合物的致毒機(jī)理提供了大量的信息。?