[發明專利]基于生物芯片的檢測核酸降解組mRNA的通用探針方法

無效

• 申請號: 201210371574.0
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN103074419A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 李炯;沈葉;鄭克孝;趙轉
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京華夏博通專利事務所(普通合伙) 11264
• 代理人: 王鋒;孫東風

技術領域

本發明具體涉及一種用于核酸降解組檢測的通用探針檢測方法，屬于核酸分子檢測技術領域，

背景技術

內源性非編碼小RNA（small?non-protein-coding?RNA,?12-24nt，簡稱“小RNA”）廣泛存在于高等和低等生物體內，通過對靶基因mRNA直接切除或抑制其翻譯在轉錄及轉錄后水平對基因表達起調節作用。已知的小RNA主要分為兩大類：一類是微小RNA（miRNA,?microRNA），一類是小干擾RNA（siRNA,?small?interfering?RNA）。參閱圖1，植物miRNA、siRNA以及部分動物miRNA、siRNA主要通過與靶基因mRNA進行完全或近乎完全的配對形成沉默復合體RISC?（RNA-induced?silencing?complex），從而降解靶基因mRNA并調控其表達，且大量實驗數據表明小分子RNA介導的靶基因斷裂發生在與mRNA的互補區，主要發生在對應小分子RNA序列5’端的第十、十一位之間。常規的靶基因查找主要采用生物信息學方法在全基因組水平上進行預測和篩選。由于預測方法無法區分預測靶基因的真偽，所有預測結果必須經實驗證實，因此仍需采用各種體內外的實驗手段，如Northern雜交、改良5'RACE法（modified?5'-rapid?amplification?of?cDNA?ends），對預測的靶基因進行一一驗證。這不僅費時耗力，還大大地影響了標靶基因的探索效率。

近二十多年來，基于高通量分析的系統生物學（system?biology）研究飛速發展，各種“組學（omics）”研究不斷拓展。如今科學家們能夠借助各種檢測手段把傳統的生物學研究從小規模、低效率模式提升至大規模并且精確高效的階段。針對上述的小分子RNA靶基因檢測，2008年出現了一種降解組測序（degradome?sequencing）的檢測方法，也被稱之為RNA末端平行分析法（parallel?analysis?of?RNA?ends）。它采用高通量測序技術，對小分子RNA介導的靶基因mRNA剪切降解片段進行深度測序分析，從結果中篩選小分子RNA作用的靶基因，并結合生物信息學分析，確定降解片段與小分子RNA精確的配對信息。該方法與其它傳統實驗方法相比，可信度和檢測通量都得到了提高。但如今測序成本較高，由于不同組織中小分子RNA表達不一樣，其靶基因mRNA的降解情況也不一樣，如對多種樣品進行檢測則價格昂貴。另外，現在的高通量測序獲得的片段較短，序列需進行多次拼接，容易引入錯誤。此外，已經發展出的多種小分子RNA靶基因預測方法，測序不能對這些方法的預測結果進行一一驗證，容易造成靶基因檢測的遺漏，大大降低了降解組測序的性價比。

常規的mRNA表達譜芯片能夠獲得不同組織中各個基因mRNA的表達情況，因此也能獲得生物信息學預測的小分子RNA靶基因的表達情況，并且也有一些實驗室采用表達譜芯片來初步篩選小分子RNA的靶基因。但表達譜芯片獲得的mRNA表達情況并不一定與小分子RNA介導的靶基因?mRNA降解相關，其表達也可能受到其它途徑的調控，因此通過表達譜芯片篩選的小分子RNA靶基因仍然無法區分真偽，仍需要采用低通量的實驗手段進行驗證，也不是高通量鑒定小分子RNA介導的靶基因mRNA降解的理想方法。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中的不足，提供一種基于生物芯片的檢測核酸降解組mRNA的通用探針方法。

為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案：

一種基于生物芯片的檢測核酸降解組mRNA的通用探針方法，包括如下步驟：

1）采用生物信息學方法，預測可能被小分子RNA降解的目標核酸降解組mRNA；

2）提供檢測探針，所述檢測探針的一部分核酸序列與通用報告探針互補，另一部分核酸序列至少與所述目標核酸降解組mRNA斷裂處部分的核酸序列互補；

3）將所述檢測探針固定在生物芯片基質上，形成生物芯片；

4）將待檢測樣本的RNA和通用報告探針一起混入雜交液中與所述生物芯片雜交；

5）洗滌雜交后的生物芯片，檢測雜交結果。

作為優選的方案之一，所述檢測探針長度為18-42mer，其中與通用報告探針互補部分的核酸序列長度為3-12mer，與核酸降解組mRNA的斷裂處互補部分的核酸序列長度為15-30mer。

作為優選的方案之一，所述檢測探針中與通用報告探針互補的一部分核酸序列緊鄰與所述目標核酸降解組mRNA的斷裂處互補的另一部分核酸序列。