[發明專利]一種RNA的預備模板PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201210371539.9
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102864233A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 陳燃;伍迪;金曉錚
• 申請（專利權）人: 浙江今復康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種RNA的預備模板PCR（Template-Ready?PCR，TRPCR）檢測方法。

（二）背景技術

RNA是遺傳信息傳遞的載體。RT-PCR?（reverse?transcription逆轉錄-聚合酶鏈反應），指將逆轉錄反應?（Reverse?Transcription，RT）和PCR?（Polymerase?Chain?Reaction）?反應組合在一起的方法.?RT-?PCR將以RNA為模板的cDNA合成，即RT，同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RNA的RT-PCR檢測或定量分析，比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及?S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作，已發展成為進行基因表達水平的檢測分析，病原體的檢測分析等有力的手段。

RT-PCR的模板可以為總RNA或poly（A）+RNA.?其中RT需要用逆轉錄酶，可以用隨機引物、oligo（dT）或基因特異性的引物（GSP）起始.??RT和PCR可以在兩個反應管中分步先后進行?（兩管法），也可以在一個反應管中先后進行（一管法）。兩管法比較常見，在兩管法RT-PCR中，每一步都可以盡量在最佳條件下進行，但由于RT體系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出約5%的RT產物進行PCR，這限制了最終檢測的靈敏度，但在使用一個樣品檢測多個目標RNA時比較很有用——因為一個RT產物可以分別用于很多個PCR反應。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中進行，必須盡可能地提供同時為逆轉錄和PCR優化的條件.?一步法RT-PCR在處理大量樣品時易于操作，有助于減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋.?一步法優化成功的話，可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增?–?理論上靈敏度可以比兩管法提高20倍.?然而，為一步法RT-PCR優化的條件很難掌控，經常會帶來嚴重的非特異擴增，而且成本上有很大提升.

雖然RT-PCR在科研領域的推廣普及程度很高，但在臨床檢測應用方面，仍存在很大的改進空間.?主要問題包括:?步驟繁瑣，對操作要求高，特別是2種酶促反應?（RT和PCR）?的最優反應條件是有差異的，容易受到各種抑制物質的影響，也容易受到非特異擴增和假陽性的困擾，最后，逆轉錄酶的價格居高不下，操作成本很難降下來.

（三）發明內容

本發明目的是提供一種操作簡單快速、特異性強的用于RNA檢測的預備模板PC檢測方法。

本發明采用的技術方案是：

一種RNA的預備模板PCR檢測方法，所述方法包括：

（1）設計與目標RNA上任意一段序列互補的長度為25~40mer的單鏈寡核苷酸DNA，記為探針A；探針A的GC含量為40-60%，解鏈溫度（Tm值）為70-85^oC；將探針A錨定在PCR管內，得到錨定PCR管；探針A的錨定可以采用本領域常規方法進行，用于錨定探針A的固體介質，可以是塑料離心管，也可以是磁珠，凝膠顆粒或其他可以吸附結合核酸的固體介質；

（2）設計部分序列與目標RNA上任意的另一段序列互補的單鏈寡核苷酸DNA，其結構為:?兩端是特異的長度為20~30mer的PCR引物序列、中間為與目標RNA互補的長度為25~40merbp的序列，記為探針B；探針B?的GC含量為40-60%，解鏈溫度（Tm值）為70-85^oC，與探針A和目標RNA的結合區域互不重疊。

（3）取待測樣本，加入探針B和裂解液，反復吸打，轉移至離心管中，冰上放置20min，4℃離心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液為本領域常規含有表面活性劑（如吐溫20、NP-40等）、用于細胞或組織裂解的緩沖液；

待測樣本可來自組織或細胞，或者臨床標本如痰液、血液等；

待測樣本來自痰液時，裂解上清液獲得方法如下：1~5?ml痰液?+?5~10?ml?痰融液，37℃振蕩?10min，4℃、5000?rpm?離心10min，棄上清，取沉淀+?200?ul裂解液（其中探針B濃度為1nmol/L），反復吸打，轉移到1.5?ml?離心管中，冰上放置20min，4℃、15000?rpm?離心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液組成:?PBS+0.1%（w/vol）DTT。