[發(fā)明專利]一種RNA的預(yù)備模板PCR檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210371539.9 | 申請日： | 2012-09-27 |
| 公開（公告）號： | CN102864233A | 公開（公告）日： | 2013-01-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳燃;伍迪;金曉錚 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江今復(fù)康生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;G01N21/64 |
| 代理公司： | 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201 | 代理人： | 黃美娟;冷紅梅 |
| 地址： | 310052 浙江省杭州市濱*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 rna 預(yù)備 模板 pcr 檢測 方法 | ||
1.一種RNA的預(yù)備模板PCR檢測方法，所述方法包括：
（1）設(shè)計與目標RNA上任意一段序列互補的長度為25~40mer的單鏈寡核苷酸DNA，記為探針A；探針A的GC含量為40~60%，解鏈溫度為70~85℃；將探針A錨定在PCR管內(nèi)，得到錨定PCR管；
（2）設(shè)計部分序列與目標RNA上另一段任意序列互補的單鏈寡核苷酸DNA，其結(jié)構(gòu)為:?兩端是特異的長度為20~30mer的PCR引物序列、中間為與目標RNA互補的長度為25~40mer的序列，記為探針B；探針B?的GC含量為40~60%，解鏈溫度為70~85℃，與探針A和目標RNA的結(jié)合區(qū)域互不重疊；
（3）取待測樣本，加入探針B和含表面活性劑的細胞裂解液，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置20min，4℃離心，取上清液，得到裂解上清液；
（4）取裂解上清液20uL至錨定PCR管中，60~70℃保溫5~15min，吸干管內(nèi)液體，以洗滌液洗滌3~9次，吸干，加入20uL?由PCR緩沖液和PCR引物配制的PCR反應(yīng)液，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行熒光定量分析；
（5）以空白裂解液作為陰性對照，按照步驟（1）和（2）方法進行處理和分析，以樣本Ct值小于空白裂解液Ct值判斷為陽性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述裂解液組成如下：1%?SDS，500mmol/L?NaCl，2mmol/L?MgCl2，10mmol/L?2-巰基乙醇，0.1mg/ml?魚精DNA，0.1%?Tween20，1%?脫脂奶粉，溶劑為10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR緩沖液組成如下：50mmol/L?KCl，1.5mmol/L?MgCl2，0.2mmol/L?dNTP，5%?DMSO，0.05%?Tween20，0.4×SYBR?Green?I，0.5U/20ul?Taq酶，溶劑為10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述洗滌液為TBST緩沖液。
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