[發(fā)明專利]一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液的制備方法

無效

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• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102863629A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史林啟;陶倩;李昂;劉學(xué);張珍坤;馬如江;安英麗
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C08J3/05
• 分類號: C08J3/05;C08L33/26;C08L89/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物酶技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液的制備方法。

背景技術(shù)

脂肪酶（lipase）是一種能夠催化甘油酯類化合物水解的酶，存在于大多數(shù)生物體內(nèi)，并且密切關(guān)系到生物體內(nèi)脂類的消化、運(yùn)輸和加工。此外脂肪酶還具有界面活性，能在油水界面催化疏水性底物水解。這大大拓寬了傳統(tǒng)酶促反應(yīng)的使用范圍，也豐富了脂肪酶的作用底物種類。所以隨著生物酶技術(shù)的快速發(fā)展，脂肪酶得到了越來越多的關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于食品、造紙、日用化工、油脂化工等領(lǐng)域。然而很多脂肪酶相關(guān)的生產(chǎn)過程是在高溫下進(jìn)行的，甚至在一些儲存和運(yùn)輸途中也需要保持高溫，因此具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶有著重要的應(yīng)用價(jià)值和大量的實(shí)際需求。

目前，提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性的方法主要是將脂肪酶固定在各種載體例如多孔硅，凝膠等上。這種方法一般需要對載體進(jìn)行預(yù)處理，操作較復(fù)雜，而且固定化效率有限。此外，其得到的固定化脂肪酶大部分都在水溶液體系中使用，并不適用于微乳液體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述存在問題，提供了一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液的制備方法，通過在微乳液中簡單添加溫敏性聚合物就可以在原位顯著提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性，而且復(fù)性后使用脂肪酶時(shí)無需去除添加劑，同時(shí)這種溫敏性聚合物的添加不會影響到脂肪酶在微乳液中的界面活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液的制備方法，包括如下步驟：

1）將脂肪酶與均聚物聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）分別溶解在緩沖溶液中得到脂肪酶溶液和PNIPAAm溶液，脂肪酶的濃度為0.16mg/mL,PNIPAAm的濃度為3-15mg/mL，所述緩沖溶液為pH=7.5、濃度10mM的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），將上述兩種溶液以1:1的體積比均勻混合；

2）將表面活性劑二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸鈉（AOT）溶解在異辛烷中得到混合液，AOT與異辛烷的質(zhì)量比12.9:100，在磁力攪拌下將脂肪酶溶液與PNIPAAm溶液的混合液緩慢滴入溶有AOT的異辛烷混合液中，形成穩(wěn)定、透明、均一的微乳液，所述微乳液中W₀值為10(W₀=[H₂O]/[AOT])。

所述均聚物聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）方法合成，分子量為1470-4300Da（道爾頓）。

該脂肪酶微乳液的熱穩(wěn)定性的檢測方法：

1）將制備好的微乳液在熱水浴中加熱，然后在4℃條件下靜置令脂肪酶復(fù)性；

2）室溫下將480μL脂肪酶微乳液與20μL溶有棕櫚酸對硝基苯酯(p-NPP)的異辛烷在比色皿中快速混合后，立即通過紫外可見分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液在333nm處的吸光度變化，與未加熱的微乳液中的脂肪酶相比，得到其相對酶活性。

提高微乳液中的脂肪酶熱穩(wěn)定性的原理：

脂肪酶的熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)歷高溫后易失活，這主要是因?yàn)橹久阜肿釉诟邷貢r(shí)變性，致使酶分子之間發(fā)生不可逆的聚集，即使降溫后也無法恢復(fù)到其原本的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，溫敏性聚合物PNIPAAm與脂肪酶分子共同存在于微乳液的水相液滴中，高溫時(shí)PNIPAAm因其溫度敏感的特性而變得疏水，能與變性脂肪酶相結(jié)合，從而防止與其它脂肪酶分子發(fā)生聚集。低溫時(shí)，PNIPAAm變得親水而自動釋放脂肪酶，隨后脂肪酶可以恢復(fù)到其天然結(jié)構(gòu)，重新獲得酶活性。此外，微乳液使得體系中的聚合物和酶分子被分隔在一個(gè)個(gè)微小的受限空間中，這樣高溫時(shí)聚合物自身不會形成大的聚集體而是形成具有高比表面積的納米級顆粒，從而大大提高聚合物和酶分子之間的復(fù)合效率。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

該制備方法通過在微乳液體系內(nèi)加入溫敏性聚合物可有效提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性，溫敏性聚合物PNIPAAm易于合成，成本較低；包裹有PNIPAAm和脂肪酶的微乳液光學(xué)透明熱力學(xué)穩(wěn)定，同時(shí)可以利用脂肪酶在微乳液中的界面活性，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的儲存、遇熱保護(hù)、復(fù)性、應(yīng)用均在同一體系內(nèi)直接完成，這將幫助脂肪酶獲得更多更廣泛的實(shí)際應(yīng)用。

附圖說明

圖1為經(jīng)過高溫加熱、復(fù)性后的微乳液中的脂肪酶在沒有和有PNIPAAm存在時(shí)的相對活性對比圖。

圖2為在37℃加熱不同時(shí)間的微乳液中的脂肪酶在沒有和有PNIPAAm存在時(shí)的相對活性對比圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例：