[發(fā)明專利]制備胰腺干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基組合

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210371241.8
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN103710302B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙春華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京戈程知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備胰腺干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基組合。更具體而言，本發(fā)明涉及一種利用專用培養(yǎng)基組合將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為胰腺干細(xì)胞的方法及該專用培養(yǎng)基組合。

背景技術(shù)

糖尿病已成為全球多發(fā)且難治的代謝性疾病，是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病。國外給它的別名叫沉默的殺手（Silent?Killer）。特別是成人型糖尿病，四十歲以上的中年人染患率特別高。在日本，四十歲以上的人口中10%含有該病，即十人當(dāng)中就有一位糖尿病患者。一旦患上糖尿病，將減少壽命十年之多，且可能發(fā)生的并發(fā)癥遍及全身。

多年來，醫(yī)學(xué)界一直致力于對糖尿病的研究。這是因?yàn)橐坏┗忌稀疤悄虿　保梭w的麻煩將接踵而至，由于免疫功能減弱，人體容易感染由感冒病毒、肺炎球菌、肺結(jié)核桿菌等所引起的各種感染性疾病，而且不易治愈。這些疾病并且選擇性地破壞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞。抗癌細(xì)胞的防御機(jī)能會(huì)大大減弱，致使癌細(xì)胞活躍、聚集。難怪有這樣的說法，一旦得了“糖尿病”，壽命減去十多年。因此許多人對糖尿病談之而色變，千方百計(jì)的進(jìn)行治療。

糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型的糖尿病。其發(fā)病涉及到遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素，并以胰島素分泌不足及胰島素抵抗為主要表現(xiàn)。

胰島素是人體胰腺B細(xì)胞分泌的身體內(nèi)唯一的降血糖激素。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用于糖尿病治療，糖尿病患者早期使用胰島素和超強(qiáng)抗氧化劑（如注射用硫辛酸、口服蝦青素等）有望出現(xiàn)較長時(shí)間的蜜月期，胰島素注射不會(huì)有成癮和依賴性。

胰腺干細(xì)胞是組織特異性干細(xì)胞，其能夠分化為所有類型的胰腺細(xì)胞，從而可作為胰腺疾病損傷細(xì)胞替代治療的潛在供者細(xì)胞。然而，胰腺干細(xì)胞很難從胰腺組織中獲得并在體外擴(kuò)增。以間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞獲得胰腺干細(xì)胞將不受細(xì)胞來源的限制。

干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細(xì)胞，是細(xì)胞移植的理想細(xì)胞。在個(gè)體發(fā)育過程中，存在各種形式的干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、多能干細(xì)胞以及各種組織中的定向干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等，但在實(shí)際應(yīng)用上卻面臨倫理的挑戰(zhàn)或取材的限制。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細(xì)胞群，因其在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，且具有免疫原性低、移植后能形成穩(wěn)定嵌合等特點(diǎn)，故可作為一種理想的供異基因移植的細(xì)胞。因?yàn)镸SC亞全能干細(xì)胞可獲得向內(nèi)胚層組織分化的潛在能力、容易取材、來源更為豐富且不受倫理限制及沒有成瘤危險(xiǎn)，因此使用間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得胰腺干細(xì)胞在臨床上具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明擬開發(fā)一種培養(yǎng)基組合和一套方法以將間充質(zhì)干細(xì)胞在體外定向地誘導(dǎo)為胰腺干細(xì)胞，從而為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供一種新的選擇。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于探尋一種能將間充質(zhì)干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)為有活性的胰腺干細(xì)胞的方法和相應(yīng)的培養(yǎng)基組合。

因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種培養(yǎng)基C，其由動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度如下：0.50×10^-5mol/L-2.0×10^-5mol/L維甲酸、10ng/ml-30ng/ml?EGF、10ng/ml-100ng/ml?bFGF、20ng/ml-200ng/ml?Dkk1、0.2mmol/L-10mmol/L谷氨酰胺、體積比為0.2%-5%的非必需氨基酸以及可選的體積比為0.5%-5%的B27；優(yōu)選地，0.95×10^-5mol/L-1.05×10^-5mol/L維甲酸、19ng/ml-21ng/ml?EGF、32ng/ml-64ng/ml?bFGF、80ng/ml-120ng/ml?Dkk1、1.9mmol/L-2.1mmol/L谷氨酰胺、體積比為0.95%-1.05%的非必需氨基酸以及可選的體積比為1.9%-2.1%的B27；并且其中所述動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。