[發明專利]一種適用于對氨基偶氮苯的人工抗原合成方法

無效

• 申請號: 201210369910.8
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN102827271A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 胥傳來;李灼坤;匡華;王風艷;王利兵;劉麗強;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

對氨基偶氮苯，英文名：p-aminoazobenzene;Aniline?Yellow，4-Aminoazobenzene；化學名也叫4-氨基偶氮苯，苯胺黃；CAS號：60-09-3；分子式是C₁₂H₁₁N₃。偶氮染料(偶氮基兩端連接芳基的一類有機化合物)是紡織品服裝在印染工藝中應用最廣泛的一類合成染料，在特殊條件下，它能分解產生20多種致癌芳香胺，經過活化作用改變人體的DNA結構引起病變和誘發癌癥。偶氮是國際環保要求的必檢項目之一，檢驗方法有以下三種：薄層色譜法（TLC），氣相色譜及質譜聯用法（GC-MSD）及高效液相色譜法（HPLC）。標準規定被檢產品中不得含有23種偶氮染料中間體，若檢出其中一種即為不合格產品，其限量為30ppm。對氨基偶氮苯是這些有害芳香胺中的一種，在歐盟公布的偶氮染料標準中，對氨基偶氮苯屬于禁用芳香胺中的MAK(Ⅲ)A2組中的一種。國外大部分現行相關標準法規都將對氨基偶氮苯列入禁用芳香胺行列。如德國《食品及日用消費品法》等，而國內在涉及紡織品、染料、皮革制品的標準都沒有將其列入。由于檢測技術的限制，常規的檢驗方法無法對其進行檢測。近年來，國內外已經開展了對偶氮類免疫分析方法的研究，但國內外尚很少有針對對氨基偶氮苯的酶聯免疫檢測的報道，有必要制備能產生更好特異性抗體的對氨基偶氮苯人工抗原。

發明內容

本發明的目的是提供一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法。所制備的產品用于對氨基偶氮苯的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。

本發明的技術方案：一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，分別以對氨基苯丁酸和對氨基苯乙酸進行重氮化，重氮化產物分別與與苯胺進行反應，從而獲得2個針對對氨基偶氮苯的衍生物1：對氨基偶氮苯丁酸，和對氨基偶氮苯的衍生物2：對氨基偶氮苯乙酸；同時以對氨基偶氮苯丁酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白BSA偶聯作為免疫原用來免疫兔子產生抗體；以對氨基偶氮苯乙酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白OVA偶聯作為包被原，用來建立酶聯免疫檢測方法。

（1）對氨基偶氮苯衍生物的制備

在冰浴下（-5℃-0℃）將底物對氨基苯丁酸（358?mg，2mmol）溶于稀鹽酸中（1N，4?mL），然后加入亞硝酸鈉（138?mg，2?mmol），攪拌15min后加入苯胺（186?mg，2?mmol），整個過程保持0℃以下0.5h，反應監測（LC/MS）原料消耗完全，將此反應溶液轉至制備色譜純化，制得對氨基偶氮苯衍生物1。

同理將底物換成對氨基苯乙酸，可制得對氨基偶氮苯衍生物2。

（2）對氨基偶氮苯人工抗原的制備

取0.5mL的含有0.1mmol對氨基偶氮苯衍生物1的N,N-二甲基甲酰胺DMF，加入0.15mmol碳化二亞胺EDC和0.15mmol?N-羥基琥珀酰亞胺NHS室溫避光反應3h，為A液；將0.0025mmol?牛血清蛋白BSA溶解到0.01M、pH7.4的磷酸鹽PBS緩沖液中，為B液；然后將A液緩慢滴加到B液中，室溫反應6h，離心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液；

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；

將人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0.01M的PBS溶液透析2次和2L的去離子水透析2次，總計透析3天；最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得對氨基偶氮苯人工抗原。

（3）對氨基偶氮苯包被原的制備

將步驟（2）中的對氨基偶氮苯衍生物1替換為對氨基偶氮苯衍生物2，其余操作均與步驟（2）相同，即得對氨基偶氮苯包被原。

（4）對氨基偶氮苯人工抗原的鑒定

偶聯比測定：是估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率（偶聯比率）的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的原理分別測定被偶聯的兩種分子濃度．在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現出光譜圖迭加的性質。