[發明專利]一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法

有效

• 申請號: 201210368914.4
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102845308A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 沈曉霞;沈宇峰;王志安
• 申請（專利權）人: 浙江省中藥研究所有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及鐵皮石斛的組培技術領域，尤其涉及一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法。

背景技術

鐵皮石斛，被譽為“中華九大仙草之首”，為蘭科多年生草本植物。生于山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境，不耐高溫、干燥，不耐寒。鐵皮石斛為石斛之極品，它因表皮呈鐵綠色而得名，具有益胃生津，滋陰清熱等藥用價值。

鐵皮石斛種子微小，自然萌發率和繁殖率低，生產上的種苗均來自組織培養。目前，鐵皮石斛的組培育苗主要通過原球莖誘導、幼苗分化與壯苗培養3個階段來實現，培養時間較長、成本較高。因此，如何縮短培養時間、提高培養效率、降低培養成本已成為促進鐵皮石斛產業加速發展的當務之急。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法，包括以下步驟：

（1）制備成苗培養基：以B5為基礎培養基，每升B5培養基中添加0.1mg的6-芐氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭、3.5g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節pH值至6.0，得成苗培養基；均勻地將成苗培養基分裝于培養容器中，邊分裝邊攪拌，避免活性炭沉底，分裝完畢后加蓋；培養容器加蓋后，放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為：121℃下滅菌20分鐘，滅菌后取出培養容器，冷卻后備用；

（2）鐵皮石斛果實滅菌：將鐵皮石斛果實放入水中清洗干凈；在無菌條件下，將鐵皮石斛果實在體積百分比濃度為75%的乙醇溶液中浸泡1分鐘，取出用無菌水清洗若干遍，放入體積百分比濃度為2%的次氯酸鈉溶液滅菌10分鐘，再用無菌水清洗若干遍，吸干水分后放入無菌培養皿中備用；

（3）接種：解開鐵皮石斛果實的果皮，把種子均勻地灑在成苗培養基表面，蓋緊蓋子；

（4）培養：將完成接種的培養容器移入培養室，培養條件為：溫度25℃，光照時間每天12小時，光照強度l500～2000lx，培養時間約為3個月，得到0.5-1.0?cm的幼苗；?

（5）轉接：首先配置壯苗培養基：每升B5培養基中添加0.5mg?的6-芐氨基嘌呤、1.0mg的α-萘乙酸、3.0g的活性炭、3.0g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節pH值至6.0，得狀苗培養基；然后將幼苗轉接至壯苗培養基，繼續培養，直至苗高5-6cm時，移栽至大棚。

本發明的有益效果是：本發明通過合理掌控兩種激素用量及相互間的配比，以及其他輔料的添加，促進鐵皮石斛種子一步成苗，而不必經過原球莖階段，縮短培養時間2個月左右，降低了經濟成本。轉接結果也表明，一步成苗培養成的組培苗長勢旺盛，符合生產所需，可作為鐵皮石斛生產種苗的重要來源。

具體實施方式

本發明鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法，包括以下步驟：

1.成苗培養基準備

（1）配制：以B5為基礎培養基，每升B5培養基中添加0.1mg?的6-芐氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭，3.5g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節pH值至6.0，得成苗培養基。

（2）分裝：均勻地將培養基分裝于培養容器中，邊分裝邊攪拌，避免活性炭沉底，分裝完畢，加蓋。

（3）滅菌：培養容器加蓋后，及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為：121℃下滅菌20分鐘，滅菌后及時取出培養容器，冷卻后備用。

2.外植體滅菌

先清洗：將外植體鐵皮石斛果實放入清水中，加少許洗潔精，清洗果實表面，后用流水沖洗干凈。

滅菌：事先將鑷子和燒杯滅菌，在無菌條件下，用鑷子將果實在體積百分比濃度為75?%的乙醇溶液中浸泡1?分鐘，取出用無菌水清洗2遍，放入體積百分比濃度為2%的次氯酸鈉溶液滅菌10?分鐘，再用無菌水清洗6遍，吸干水分，放入無菌培養皿中備用。

3.接種

用無菌解剖刀解開鐵皮石斛果實的果皮，把種子均勻地灑在培養基表面，立刻蓋緊蓋子。

4.培養

將完成接種的培養容器移入培養室，培養條件為：溫度25℃，光照時間每天12小時，光照強度l500～2000lx，培養時間約為3個月，得到0.5-1.0?cm的幼苗；培養期間要勤檢查，發現污染及時移除。

5.轉接