[發(fā)明專(zhuān)利]一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210368263.9
• 申請(qǐng)日: 2012-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103698311A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李錚;劉鋒;朱勇;何琳;劉宇飛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/65
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/65
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 金重慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種精子形態(tài)與結(jié)構(gòu)分析方法，具體地說(shuō)，是一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法。

背景技術(shù)

目前全世界約有20％育齡夫婦患有不孕癥，不孕癥中男性原因占50％左右，而在男性不育癥中約60％以上原因?yàn)樯佟⑷蹙影Y，究其原因尚不完全清楚。目前許多醫(yī)院的臨床醫(yī)師，還是依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)精液分析指標(biāo)，選擇臨床治療方案。盡管常規(guī)精液分析的應(yīng)用具有悠久的歷史，但許多醫(yī)療單位至今仍然在使用人工顯微鏡分析技術(shù)；灰度計(jì)算機(jī)分析精液技術(shù)（CASA，Computer-aided?sperm?analysis）分析方法在臨床上雖已經(jīng)廣泛應(yīng)用多年；而相差顯微鏡的CASA?分析方法因?yàn)閮x器價(jià)格較貴，在醫(yī)院推廣仍很有限。因此精液分析是評(píng)價(jià)成年男子生育能力和不育癥治療效果的重要手段之一，是常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，也是存在問(wèn)題最多的不育評(píng)估項(xiàng)目之一。

最新出版的WHO5（2011年2月）提出的嚴(yán)格精子形態(tài)學(xué)分析方法標(biāo)準(zhǔn)，使男性精子的形態(tài)正常比例標(biāo)準(zhǔn)降到了4%。對(duì)于人類(lèi)，用顯微鏡檢查分析精子復(fù)雜的形態(tài)學(xué)過(guò)程并不是非常有效，會(huì)產(chǎn)生各種異常的和功能不完善的精子。重要的是，研究者要分析引起這些缺陷的原因及其對(duì)生育可能造成的后果。隨著“蛋白組學(xué)”技術(shù)和方法的快速發(fā)展，我們從男性的基礎(chǔ)代謝和精子蛋白質(zhì)組學(xué)、受精的機(jī)理以及運(yùn)動(dòng)功能等研究中獲得了認(rèn)識(shí)，學(xué)者們提出了公認(rèn)的原因：精子的不育原因許多來(lái)源于精子的功能異常，其中對(duì)精子核DNA的損害是目前研究最多，而且是被越來(lái)越多地學(xué)者承認(rèn)與胚胎發(fā)育質(zhì)量和胚胎植入至關(guān)重要的影響因素之一。

近年來(lái)的研究表明精子DNA的完整性與精子活力、精子形態(tài)及精子功能有顯著相關(guān)性，并且可以影響受精卵的分裂以及胚胎的發(fā)育。但目前的精子DNA分析方法尚不穩(wěn)定，因?yàn)樗荒茏R(shí)別精子固有的分子異常，雖然有各種測(cè)試評(píng)估DNA完整性的方法，但這些辦法都是使用了各種熒光染料，對(duì)精子本身有侵入性傷害，例如彗星法、精子染色質(zhì)擴(kuò)散法（SCD）及丫啶橙流式細(xì)胞儀分析法等都是使用熒光染料。這些使用熒光染料檢查后的精子無(wú)法再給臨床應(yīng)用提供可替代選擇使用的精子。

隨著計(jì)算機(jī)及其在圖像數(shù)字處理技術(shù)方面的進(jìn)展，一門(mén)嶄新的、非侵入性、快速而靈敏的光譜學(xué)檢測(cè)方法，激光拉曼*(Raman)?光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛，被逐步應(yīng)用于各種細(xì)胞分類(lèi)和鑒別研究工作中。在這里不僅可以觀察細(xì)胞形貌，而且還能檢測(cè)出表征細(xì)胞形態(tài)的峰譜，它包含了單純形貌觀察得不到的更豐富的信息，通過(guò)這些信息反映出細(xì)胞的物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)的變化，這在生物遺傳及臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的研究進(jìn)程中有潛在的應(yīng)用前景。目前使用激光拉曼光譜系統(tǒng)對(duì)單個(gè)精子形態(tài)分析方法的建立研究尚未見(jiàn)報(bào)道

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法，所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟：運(yùn)用色散型共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行分析，選擇激發(fā)拉曼光譜，將精子細(xì)胞置反射光鏡下中，通過(guò)一定的激發(fā)功率和曝光時(shí)間可采集到精子細(xì)胞的化學(xué)基團(tuán)光譜。分別對(duì)精子頂體、頸部、尾部大小劃分掃描區(qū)域重復(fù)掃描三次，即可獲得拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其波形變化和位移；最后將采集到的精子形態(tài)的拉曼光譜，應(yīng)用RRUFF拉曼數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到精子形態(tài)各區(qū)域的拉曼光譜。

所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟：

（1）選擇激光激發(fā)波為532nm，激光功率5mW，激發(fā)拉曼光譜，曝光時(shí)間為10s；

（2）激光拉曼顯微鏡掃描參數(shù)：入射光調(diào)節(jié)為反射光，拉曼分析平移，即每個(gè)點(diǎn)掃描移動(dòng)時(shí)，控制精度為1?um；

（3）根據(jù)精子形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)精子頂體、頸部、尾部大小，即頂體寬度3.1-3.5um，頂體長(zhǎng)度為4.5-4.9um，頸部長(zhǎng)度為4.0-5.0um劃分掃描區(qū)域：分別對(duì)精子頂體前區(qū)（質(zhì)膜）定點(diǎn)掃描3個(gè)點(diǎn)、頂體中間(DNA核區(qū))定點(diǎn)掃描4點(diǎn)、頂體后區(qū)(赤道板部)定點(diǎn)掃描3點(diǎn)、頸部(線粒體區(qū))部定點(diǎn)掃描7點(diǎn)、尾部（微管區(qū)域）定點(diǎn)掃描8點(diǎn)，五個(gè)劃分區(qū)域共定點(diǎn)掃描23點(diǎn)進(jìn)行掃描，并重復(fù)掃描三次，將獲得精子拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其峰譜變化和位移。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明采用的激光拉曼光譜為一種非侵入性技術(shù)，它不需要任何染料和固定也能反映出每條精子不同個(gè)體超微結(jié)構(gòu)、不同成分的散射物質(zhì)的特性，與激光的頻率和激光的強(qiáng)度無(wú)關(guān)；?